Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

De functionaliteit van synaptische blaasjes is een belangrijke determinant van synaptische transmissie. Deze blaasjes vrijkomen neurotransmitters als ze fuseren met de presynaptische plasmamembraan (exocytose), en worden ze klaar voor een nieuwe cyclus van vrijlating na wordt geregenereerd uit het plasmamembraan (endocytose) en herladen met neurotransmitter. Onderzoek naar de dynamiek van en de onderliggende mechanismen van synaptische blaasje recycling is sterk versneld door de invoering van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen ^1. Deze amfipatische moleculen, die positief hebben geladen hydrofiele kopgroepen en hydrofobe staarten (meerdere kleurstoffen in figuur 1A, stereoview van FM1-43 in Figuur 1B), kunnen reversibel invoeren en lipide membranen verlaten zonder doordringt hen. Groepen van FM kleurstoffen onderlinge overeenkomsten vertonen dat het bereik van het licht dat ze uitstralen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, FM2-10, FM1-43, en FM1-84 hebben een dubbele binding tussen twee cyclische verbindingen en show groene emissie. Het verschil tussen hen is de lengte van de hydrofobe staart, die haar hydrofobiciteit bepaalt en daarmee de snelheid van uitgang uit het membraan (departitioning). In het geval van FM5-95 en FM4-64, drie dubbele bindingen verbinden de cyclische verbindingen, en ze tonen rode emissie. Deze kleurstoffen verschillen met betrekking tot hun hydrofiele delen. In alle FM kleurstoffen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer ze worden ingebracht in biologische membranen, door een toename in de quantum opbrengst in de hydrofobe omgeving ten opzichte van de hydrofiele omgeving. Dus de veranderingen in de FM-intensiteit geven de veranderingen in de membraan omzet. De verschillende kleuren (emissie spectra) en hydrofobiciteiten maken van de FM-kleurstoffen een veelzijdig onderzoeksinstrument in synaptische blaasje recycling.

Op basis van deze eigenschappen worden de FM kleurstoffen meestal gebruikt volgens het volgende schema bij het ​​analyseren synaptische vesikel recycling (figuur 2). Neurons baden in een extracellulaire oplossing die het FM kleurstof, waardoor het worden opgenomen in synaptische blaasjes (SV) aangezien zij via endocytose (kleuring). De kleurstof wordt vervolgens weggewassen door een kleurstof vrij extracellulaire oplossing, dit toont de functionele zenuwuiteinden, namelijk alleen die actief ondergaan endocytose wordt een cluster van synaptische blaasjes die worden geladen met de kleurstof (figuur 2 beneden) bevatten. Na exocytose leidt tot verlies van de FM kleurstof aan de extracellulaire ruimte en een gelijktijdige verlies van fluorescentie (ontkleuren, door zowel de departitioning een hydrofiel milieu en diffusie vanaf de plaats van exocytose). Daarom zijn de veranderingen in de FM-fluorescentie-intensiteit zijn indicatoren van synaptische blaasjes exo-en endocytose.

FM kleurstoffen zijn gebruikt om vlekken en Destain de synaptische blaasjes in verschillende organismen en preparaten ^2,3. Voorbeelden zijn zoogdieren neuronale culturen ^4-9, zoogdierbrein plakjes ^10,11, neuromusculaire verbindingen ^12,13, retinale bipolaire neuronen ^14,15 en haarcellen van slakkenhuis ^16.

Meestal in dergelijke experimenten, zowel kleuren en ontkleuren worden getriggerd door uitvoerig stimuleren van de neuronen (opgeroepen activiteit). Onlangs echter synaptische vesikel recycling reactie op zwakke stimulatie ook geanalyseerd, evenals recycling in afwezigheid van een externe stimulus (spontane en miniatuur synaptische activiteit) ^9,17-19. Spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden gedefinieerd als die die in afwezigheid van externe stimuli, met de voormalige waarbij spontane afvuren van actiepotentialen (figuur 3). Deze zwakke synaptische activiteiten geassocieerd met kleinere veranderingen FM signalen dan die veroorzaakt door uitgebreide stimulatie. De meting vereist dat de veranderingen in de FM-tllingen intensiteit nauwkeurig weergeven synaptische vesikel exocytose of endocytose maar niet artefactuele veranderingen in intensiteit. Een oorzaak van het artefact is de aanwezigheid van niet-specifieke kleuring van de plasmamembraan door FM kleurstoffen. Geleidelijke uitspoeling van deze component leidt tot een geleidelijke verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit die ten onrechte wordt toegeschreven aan synaptische activiteiten. Deze factor kan worden verminderd door geschikte methoden (zie Protocol). De meest opvallende oorzaak van het artefact is de photobleaching van FM kleurstof vastgehouden binnen synaptische blaasjes. De photobleaching gerelateerde veranderingen in FM intensiteit moet klein zijn in vergelijking met de biologische (synaptische) veranderingen die worden gemeten. De recente ontwikkeling van gevoelige camera's, zoals het elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting (EMCCD) camera maakt het mogelijk fotobleken door het verkorten belichtingstijd en verzwakking van de intensiteit van het licht gebruikt om de fluorofoor wekken minimaliseren. Een andere oorzaak van het artefact is een drift in de nadruk niveau van de lichtmicroscoop. De focus drift tijdens een opnamesessie kan worden veroorzaakt door mechanische of thermische effecten, en ten onrechte leiden tot een verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit.

Hier beschrijven we protocollen en apparatuur die het mogelijk maken FM kleurstoffen om synaptische vesikel recycling analyseren zelfs in het kader van zwakke of geen stimulatie met name de miniatuur synaptische activiteit. We tonen voorbeelden van de kleuren en ontkleuren van blaasjes tijdens opgewekte en spontane synaptische gebeurtenissen, met behulp van gekweekte knaagdier hippocampus neuronen, en beeldvorming van het ontkleuren fase. We tonen ook hoe de mate van FM kleurstof fotobleking evalueren, bij het ontbreken van een FM-kleurstof verlies als gevolg van synaptische activiteiten.