Drosophila har vist sig som en markant model system til at dissekere de cellulære og molekylære fundament for adfærdsmæssige reaktioner på alkohol. Her præsenterer vi en protokol for indsamling af alkohol følsomhed data i en døgnrytmen sammenhæng, der nemt kan anvendes på andre eksperimenter og er velegnet til bachelor forskning.
Bananfluer (Drosophila melanogaster) er en etableret model for både alkohol forskning og døgnrytmen biologi. For nylig viste vi, at døgnrytmen ur modulerer alkohol følsomhed, men ikke dannelsen af tolerance. Her beskriver vi vores protokol i detaljer. Alkohol administreres til fluer ved hjælp af Flybar. I denne opsætning er mættet alkohol damp blandet med befugtet luft i sæt proportioner, og administreres til fluer i fire rør samtidigt. Fluer opdrættes under standardiserede betingelser for at minimere variation mellem replikater. Tre dage gamle fluer af forskellige genotyper eller behandlinger anvendes til forsøgene, fortrinsvis ved at matche fluer to forskellige tidspunkter (f.eks CT 5 og CT 17), hvilket gør direkte sammenligninger. Under eksperimentet er fluer eksponeret i 1 time til den forudbestemte procentdel af alkohol damp og antallet af fluer, der udviser tab af vridningsrefleks (Lorr) eller sedation tælles hver 5 min. De data kan analyseres ved hjælp af tre forskellige statistiske metoder. Den første er at bestemme det tidspunkt, hvor 50% af fluerne har mistet deres opretningsrefleksen og bruge en analyse af varians (ANOVA) for at afgøre, om der er væsentlige forskelle mellem tidspunkter. Den anden er at bestemme den procentvise fluer, der viser Lorr efter et bestemt antal minutter, efterfulgt af en ANOVA-analyse. Den sidste metode er at analysere hele tidsserier hjælp multivariat statistik. Protokollen kan også bruges til ikke-døgnrytmen eksperimenter eller sammenligninger mellem genotyper.
Drosophila melanogaster demonstrere dobbeltfasede adfærdsmæssige reaktioner på alkohol 1, som er analoge til de menneskelige reaktioner på dette stof 2,3. Ved første eksponering for lave koncentrationer af alkohol, fluer udviser forøget bevægelsesaktivitet, erstattet af en manglende koordinering motor, tab af postural kontrol og oprettende reflekser (tab af stabilitetsrefleks: Lorr) og sedation (komplet mangel på motorisk aktivitet i svar til mekanisk stimulering) udsættelse for alkohol skrider 4-9. Den endogene døgnrytmen ur er en stærk modulator af alkohol følsomhed og toksicitet som observeret i mus 10,11, rotter 12, og mennesker 13.. Nylige fremskridt i Drosophila forskning har vist, at døgnrytmen ur modulerer akut alkohol følsomhed, men ikke alkohol tolerance 1. De kraftige genetiske metoder til rådighed i Drosophila gennem mutant undersøgelser og transgene manipulationer af rumligeog tidsmæssig genekspression giver et system, der tillader hurtige fremskridt med at identificere de underliggende cellulære og molekylære mekanismer for kompleks adfærd. Brugen af Drosophila som en undersøgende værktøj er tilladt materielle fremskridt i forståelsen af alkohol neurobiologi, som hurtigt kan oversættes til pattedyr 14-16. For at lette forståelsen af de molekylære mekanismer gennem hvilke døgnrytmen ur modulerer alkohol følsomhed og til ensartet at måle adfærdsmæssige reaktioner på tværs af døgnrytmen tidspunkter, en alkohol administration protokol er egnet til anvendelse i svagt rødt lys er påkrævet. For Drosophila kan alkohol administreres gennem fødevarer tilskud til kronisk eksponering eller pålideligt gennem administration af alkohol i form af damp ved akutte eksponeringer. Her beskriver vi en alkohol administration protokol egnet til vurdering af døgnrytmen modulation af tab af vridningsrefleksen (Lorr) 1 samtsedation.
Fluer medføres med 12 timer: 12 timer LD cyklusser ved konstant temperatur og derefter overført til en kontrolleret enkel ordning for 2-5 dage afhængig af den eksperimentelle spørgsmål. Fluer udsættes for ethanoldamp i en indretning kendt som Flybar. I denne anordning er kontrollerede mængder af luft bobles gennem vand og alkohol; dampene blandes derefter og ledes ind i et hætteglas indkapsling fluer. Hver 5 min fluerne er scoret for det antal, der undlader at vise oprettende reflekser eller er blevet bedøvet. Lorr procentsatser for hvert tidspunkt beregnes og sammenlignes blandt døgnrytmen tidspunkter eller mellem stammer af fluer. Enkeltheden og pålideligheden af alkohol levering vha. Flybar alkohol levering kombineret med adfærdsmæssige muligheder analyse giver en betydelig fordel for døgnrytmen eksperimenter udført under mørke forhold.
Omkostningerne ved alkoholmisbrug og alkoholisme for samfundet er enorme, både i form af menneskelige 29 og økonomiske omkostninger 30,31. Drosophila som model tilbyder en hurtig og alsidigt system til hurtigt at undersøge de adfærdsmæssige reaktioner i et stort antal personer, og som sådan har været flittigt brugt til både alkohol 5,7,32-34 og døgnrytmen forskning 35-37.
Her beskrev vi en enkel protokol til kontrolleret administr…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen af denne forskning blev leveret af et program i Neuroscience Award fra Florida State University College of Medicine og støtte fra Institut for Biologisk Fakultet på FSU. Yderligere finansiering blev leveret af en Grant-in-Aid fra Alcohol Beverage Producentens Research Fund.
Alcohol 190 proof | Various | ||
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
Vial | VWR | 89092-722 | |
Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
Very fine nylon netting | VWR | Various | |
15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
Mini Flashlights with red filters | Mag-light |