Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie
Summary
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in het bloed. Neutrofielen bezitten transcriptioneel gereguleerd functies zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Deze functies kunnen worden bestudeerd met de methode die hier gepresenteerd, die detectie en kwantificering van nucleaire factoren maakt het mogelijk door middel van flowcytometrie in geïsoleerde kernen
Abstract
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed. Deze cellen zijn de eerste om te verschijnen op plaatsen van ontsteking en infectie, zo wordend de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Neutrofielen over belangrijke antimicrobiële functies zoals fagocytose, afgifte van lytische enzymen en de productie van reactieve zuurstof species. Naast deze belangrijke afweerfuncties, neutrofielen andere taken in reactie op infectie, zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Cytokines werven andere leukocyten waarmee de infectie, en remming van apoptose kan de neutrofielen langer leven op de plaats van infectie. Deze functies worden geregeld op het niveau van transcriptie. Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met conventionele methoden reportergen aangezien er geen effidoende technieken voor neutrofiel transfectie. Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken pure neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie. De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB en Elk-1 nucleaire factoren detecteren kernen van neutrofielen en andere celtypes. Aldus is deze methode is een optie voor het analyseren activering van transcriptiefactoren in geïsoleerde kernen van verschillende celtypen.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed 1. Tijdens ontsteking en infectie neutrofielen de eerste cellen te verschijnen op de aangetaste plaats waar zij als eerste verdedigingslijn 2. Neutrofielen bezitten verscheidene antimicrobiële mechanismen 3 met fagocytose, productie van zuurstofradicalen, afgifte van lytische enzymen door degranulatie en productie van pro-inflammatoire cytokines 4,5. Neutrofielen zijn kortstondige cellen die snel krijgen geactiveerd door middel van signalering van verschillende receptoren op het celoppervlak. Hoewel neutrofielen werden beschouwd terminale cellen vanwege hun korte levensduur en omdat ze apoptose ondergaan tenzij geactiveerd tijdens het ontstekingsproces 6 is nu duidelijk dat zij ook hun fenotype wijzigen door het niveau van transcriptie van bepaalde genen. De productie van cytokines 5 en de remming van apoptose 7,8 zijn twee iELANGRIJKE activatie-afhankelijke cel functies geregeld op het niveau van transcriptie in neutrofielen. Nucleaire factor kB (NF-kB) participeert in de transcriptionele controle van cytokineproductie 4 en in de regulatie van cel overleving en apoptose 9-11 in verschillende celtypes.
De signaalwegen die leiden tot activatie nuclear factor meestal bestudeerd door reportergen assays of door elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA). Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met reportergen assays, omdat er geen efficiënte technieken voor neutrofiel transfectie. EMSA assays zijn gebruikt in neutrofielen nucleaire factor activatie 12,13 ontdekken, maar deze methode is ingewikkeld en duur omdat het het gebruik van radioactief materiaal. Nucleofectie is een andere techniek die gebruikt successfully aan monocyten 14 transfecteren. Dus, althans in theorie zouden nucleaire factor activering gedetecteerd in neutrofielen door transfectie (ondanks laag rendement). Dit zou echter techniek duurder, tijdrovend en waarschijnlijk minder kwantitatieve. Microscopische analyse van immuun-cellen kunnen ook worden gebruikt om nucleaire factoren detecteren in de kern. Inderdaad hebben we ontdekt NF-kB translocatie naar de kern zo 15. Helaas is deze techniek ook tijdrovend, minder kwantitatieve, en onder voorbehoud van vooringenomenheid van de waarnemer.
Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken voor neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen via integrines of Fc-receptoren met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie (Figure 1). De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB 15 en Elk-1 16 nucleaire factoren in neutrofielen kernen detecteren. De gevoeligheid van deze methode kan de aanwezigheid van kleine wijzigingen in de nucleaire factor niveaus in de kern. Deze methode kan ook worden gebruikt om het niveau van transcriptiefactoren in kernen van andere celtypen analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zuiveringswerkwijze hier beschreven kan de isolatie van gestimuleerde neutrofielen (PMN) met zuiverheid van meer dan 95% (bepaald door microscopische waarneming), in een korte tijd. Soms neutrofielen kunnen worden verontreinigd door erytrocyten indien deze niet volledig gelyseerd. Dit heeft meestal geen invloed de techniek, aangezien erytrocyten en PMN kan gemakkelijk worden onderscheiden als afzonderlijke celpopulaties door flowcytometrie. Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder recept…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Nancy Mora bedanken voor haar technische bijstand.
Dit werk werd gefinancierd door subsidies voor onderzoek 48573-M en 168098 van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico, en door subsidies IN212308 en IN205311-2 van Dirección General de Asuntos del Persoonlijke academico, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Mexico.
Materials
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
