Изоляция, обработки и анализа мышиного десен Клетки
Summary
Это исследование описывает эффективный способ изолировать и обработки тканей десны от мыши полости рта с целью получения одной клеточной культуры. Полученные клетки могут быть использованы для дальнейшего анализа потока цитометрии и молекулярных исследований.
Abstract
Мы разработали методику точно изолировать и обрабатывать мышиные десневой ткани для проточной цитометрии и молекулярных исследований. Десны является уникальным и важным ткани для изучения иммунных механизмов, поскольку он участвует в иммунный ответ против оральный биопленки, которые могут вызывать заболевания периодонта. Кроме того, в непосредственной близости от десны к альвеолярной костной ткани позволяет также изучение костного ремоделирования при воспалительных процессах. Наш метод дает большое количество иммунных клеток, что позволяет анализировать даже редкие популяции клеток, таких как клетки Лангерганса и Т-регуляторные клетки как мы показали ранее 1. Используя мышей для изучения местных иммунных реакций, участвующих в потеря альвеолярной кости при заболеваниях пародонта является выгодной из-за наличия различных иммунологических и экспериментальных средств. Тем не менее, из-за их малого размера и сравнительно неудобным доступ к мышиным десны, многие исследования избежать рассмотрение эту темус критической ткани. Метод, описанный в этой работе могли бы способствовать анализу десен, которые, будем надеяться увеличить наши занижение на устном иммунной системы и ее роль во время заболевания пародонта.
Introduction
Десны мягких тканей, окружающих шейном отделе зубы и покрывает альвеолярного отростка (рис. 1). Десны является одним из видов жевательной слизистой, которые могут быть далее разделены на эпителий слизистой оболочки и соединительной ткани (также известный как подслизистой или собственной пластинке слизистой оболочки). Анатомическое строение десны и соседних зубов позволяет бактериям жить и развиваться налета (биопленки), которые постоянно бросает вызов местной иммунной системы. В результате воспалительной реакции развивается в десне, которая в некоторых случаях становится разрушительной – состояние называется заболеваний пародонта 2. В основном, бляшка индуцированного периодонтальной патологии можно разделить на гингивит и периодонтит. Гингивит представляет собой обратимое состояние местной воспалительной реакции, которая приурочена к десне. Периодонтит, с другой стороны, является необратимым деструктивный процесс, в котором крепление аппарат (альвеолярной кости, периодонтальноесвязки, цемента и десной) разрушается 3.
Десны было предложено служить как эффекторные и индуктивных сайтов во время заболевания пародонта 4. Человека исследования показали, что в ответ на зубной налет, иммунные эффекторные клетки и молекулы динамически проникли или отправления десны 5-7. Данное мероприятие было показано, играют важную роль в разрушении пародонта 8,9. Принимая во внимание данные, полученные в этих исследованиях содержится ценная информация относительно этого патологического процесса, работа с тканями человека обладают основных этических, технических и экспериментальных ограничений. Развитие экспериментальной модели позволило причинно-следственных экспериментов с помощью использованием трансгенных мышей и в естественных вмешательства 10. В результате, наши знания о механизмах, участвующих в пародонтозом значительно увеличилось в течение последних двух десятилетий. Тем не менее, из-за сложности заболеваний пародонта, существуетПродолжается дискуссия о природе местного иммунного ответа содействие разрушению ткани. Существует также отсутствие в нашем понимании на функции центральных иммунных клеток в десны при заболеваниях пародонта. Таким образом, важно, чтобы изучить патологических воспалительных реакций, происходящих в ткани-мишени заболевания, десны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maxilla тканей десны, полученные из одной мыши достаточны для анализа субпопуляции Т-и В-лимфоцитов, а также их способность выразить внеклеточных и внутриклеточных молекул, как мы ранее описанных 1. Тем не менее, если редких клеточных популяций представляют интерес (например, ДК), рек?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами от Израиля научного фонда (№ 1418/11) и в АНН (№ 1933/12), чтобы AW, немецкий Израильского фонда для молодых исследователей (GIF младших) Ах, и д-р я . Cabakoff благотворительный фонд исследований в Еврейском университете Хадасса школы зубоврачебной медицины в АНН и AW.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
