Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi
Summary
Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık.
Abstract
Segmentasyon omurgalılarda bir periyodik ve ardışık morfojenetik süreçtir. Vücut ekseni boyunca Somitlerin denilen doku blokları bu ritmik oluşumu gelişen embriyo desenlendirme genetik osilatör kanıtıdır. Zebra balığı, hücre içi saat sürüş segmentasyon negatif geri besleme döngüleri halinde organize Onun / Hes transkripsiyon faktörü ailesinin üyelerinden oluşur. Biz son zamanlarda presomitic mezoderm (PSM) içinde salınımlarının uzay-zamansal desen özetlemek döngüsel gen Her1 için transgenik floresan muhabiri hatları yarattı. Bu satırları kullanarak, tek, izole PSM hücrelerin içinde segmentasyon saat salınımlarının gerçek zamanlı analiz sağlayan in vitro kültür sistemi geliştirdi. Transgenik embriyolar PSM dokusunun çıkartılması ve daha sonra cam alt yemekler üzerine bölgelerini salınan hücreleri dağıtılarak, biz floresan sinyalinin zaman atlamalı görüntüleme gelen uygun kültürleri oluşturulanBireysel saat hücreleri. Bu yaklaşım kendi hücre-özerk ve doku düzeyi özellikleri ayırt ve disseke izin vererek, görülmemiş tek hücreli çözünürlükte segmentasyon saatin doğrudan manipülasyon için bir deneysel ve kavramsal bir çerçeve sunmaktadır.
Introduction
Omurgalı vücut ekseni, ya da somitogenesis boyunca bölümlerinin periyodik oluşumu, gelişmekte olan embriyonun bir mekansal ve zamansal osilatör kanıtıdır. Somitogenesis kontrol tercih mekanizması kavramsal şimdi hücre siklik genlerin 2 bir dizi ritmik ifadesi tarafından tahrik edilmesi düşünülen hücresel osilatörler oluşan "saat", oluşumunu kapalı keneler buradaki bir "saat ve Wavefront" modeli 1, tarafından açıklanan bir Somitlerin presomitic mezoderm (PSM) dan. Embriyo geliştikçe, PSM bir olgunlaşma "Wavefront" yavaşlatma ve 3 geçer gibi hücresel osilatörler tutuklanması, posterior doğru gerileyen dokusu ile uyum içinde hareket eder. Birlikte, bu spatiotemporally dinamik sistem bölümleme saati denir. Segmentasyon saat SPAN yerel bağlama inci tek hücrelerde genetik osilatör gelen üç organizasyon artan düzeyde çalışma Güncel yaklaşımlar, hücreler ve son olarak toplu doku PSM 4 konum bilgileri ve küresel düzenlemeye arasında ortaya çıkar.
Önceki çalışmalar zebrabalıkları hücre özerk segmentasyon osilatör transkripsiyon baskının 5-7 ile bir negatif geri besleme döngüsü oluşturmak için düşünülen factorfamily onun / hes transkripsiyon, genlerin ve protein ürünlerden oluşmaktadır öneririz. Delta / Çentik sinyal yolu komşu hücreler arasındaki salınımlar eşitler ve nüfusun 8-10 toplu süre düzenler. Tailbud üretilen fgf sinyal molekülleri Zebrafish PSM degrade oluşturmak için görünür ve böylece anterior 11 salınan hücreleri yavaşlama ve tutuklamaya katkıda varsayılır. Şimdiye kadar, somitogenesis bu moleküllerin her birinin fonksiyonel rolleri genetik mutasyon, morfolino enjeksiyon, ısı-şok aşırı ifadesi ve antagonist ilaç trea tarafından incelenmiştirsaat bileşenleri ve hücreler arası sinyal 5,7,10,12 tment. Bu tedirginlikler kullanarak, segmentasyon saat fonksiyonu doku düzeyinde somite kusurları açıklamaları ve Her1, her7 ve delta gibi döngüsel genlerin ifadesinde üniforma salınımlarının kaybı olayla olmuştur C. Ancak, neredeyse tüm bu verilerin sabit embriyolar ve doğru bir segmentasyon saatin dinamik işlevi doğasında olan değişiklikleri yakalamak için başarısız. Daha yakın zamanlarda, birden fazla embriyo time-lapse görüntüleme değişmiş osilatör dönemi ile ilk mutantlar ortaya koymuştur, ancak bu gözlemler, aynı zamanda doku seviyesi 7,13 yapılmıştır. Bu nedenle, somitogenesis sırasında varsayılmış hücreye otonom osilatör davranışı gözlenmemiştir.
Doğal olarak, işlem, bir titreşimli sistem tarafından tahrik edilir, çünkü somitogenesis statik anlık eksik bir görüntü verir. Fare ve civciv hücrelerinde önceki çalışmaları gösterdi transkript düzeylerive protein yükselişi ve düşüşü, ancak yaklaşık 2 saat salınım her 30 veya 45 dakika örnekleme mutlaka toplanan veri ve 14,15 çizilebilir nedenle sonuçlar kısıtlar. Diğer biyolojik osilatörler çalışma, en önemlisi, sirkadiyen saatler, gerçek-zamanlı floresan ve biyolüminesens gazetecilere 16,17 kullanarak izleme uzak gen ve protein ifade sahnelenen ölçümlerinden taşındı. Bu araçlar tek hücreler 18 saat özelliklerini göstermek için gereklidir. Hes1 siklik geninin bir bio-ışıldar haberci geliştirilmiş ve kısa bir süre için tek bir fare PSM hücre 19 ile karakterize edilmiştir. Ortalama süresi ve varyans salınımlar in vitro çok döngü boyunca devam olduğunu gösteren küçük bir hücre sayısı hesaplandı. Ancak bu çalışmalar kantitatif hücreleri kendiliğinden girmek veya çıkmak salınımlar olup olmadığını, osilatör frekans ve genlik kararlılık ve sağlamlık ele vermedi,ve nasıl hücreler faz ilişkileri sürdürmek. Buna ek olarak, hücre-özerk saati embriyo bulunan sinyal molekülleri etkiler, test edilmemiştir. Sonuç olarak, tek bir hücre osilatör bu temel özellikleri tamamen bilinmemektedir.
Biz son zamanlarda Her1 ifade 30 Venüs (YFP) floresan gazetecilere sürücü BAC Recombineering 20 kullanılarak transgenik balık hatları geliştirdik. Bu çizgiler gömülü ve temporal dinamikleri ve Her1 uzamsal desen özetlemek edildiği dokunulmamış kromozomal düzenleyici ipuçları yararlanılmaktadır. Bu buluş, in vivo, gelişmekte olan embriyonun zebrafish gen ifadesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Temel hücre özerk salınım özellikleri ve ne tür ifade zaman içinde düzenlenir incelemek için, son zamanlarda in vitro PSM hücrelerinden izole etmek ve kaydetmek için güvenilir bir yöntem geliştirdi. Bu protocol biz tek hücrelere Zebra balığı segmentasyon saatin salınımlarını karakterize hangi dağınık hücre kültürleri, üretmek bizim transgenik muhabiri hatları kullanmıştır anlatıyor. Biz böylece üstün statik veya doku düzeyinde analiz ile erişilebilir değil alanındaki soruları, hem de doğrudan sinyal molekülleri ve inhibitörleri ile tek hücre düzeyinde segmentasyon saatini manipüle üstesinden gelebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embriyonik gelişim boyunca yer alan bir hücresel süreç çalışma için, biyologlar tipik olarak tüm embriyo bağlamında bir yaklaşımı kullanır. Ancak, tam bir tek hücre gelişimsel bir zaman çerçevesinde nasıl davrandığını anlamak, incelemek ve izolasyon bireysel hücrelerin perturb bir yöntem de son derece faydalıdır. Transgenik zebra balığı embriyoları kullanılarak dağıtıldı PSM hücre kültürleri üreterek artık doğrudan bir nicel şekilde segmentasyon saat genetik salınımlarının hücre özerk doğasını incelemek için bir araç var. Bu, çeşitli koşullar altında hücre yüzlerce bizim floresan haberci olarak salınım dinamiği ölçmek mümkündür.
Kültür içinde tek hücre gözlenen süre sağlam embriyo somitogenesis süresinden daha uzundur. Bu kültürde, bozulmamış bir PSM eksplant da tha düşündüren, dokunulmamış embriyo (veriler gösterilmemiştir) daha yavaş salınımların sergiler gözlemlemekt izole edilmiş hücrelerde gözlemlenen daha uzun bir süre dağılımı gelen hasara karşı sadece bağlı değildir. Bir değişken periyodu ve genliği bizim tek hücreli zaman serilerinin çoğunda görülmektedir. Bu değişkenlik kaynağı bilinmiyor, ancak segmentasyon saatin hızı verme devreleri hakkında önemli ayrıntılar ortaya koymalıdır.
Bu yöntem ile biz bütün embriyo incelemek için zorlu genetik hücresel düzeyde segmentasyon bileşenleri ve adres çalışma soruları olabilir. Örneğin, kültürlere gelişen embriyonun bulunan bilinen sinyal molekülleri kontrollü eklenmesiyle, bir sağlam ve tekrarlanabilir bir deneyde bir PSM hücre osilatör üzerindeki etkilerini incelemek. Bizim PSM kültür sistemi bu titreşimleri engelleyen faktörler neler, yalnız, faktörleri, veya birlikte, bu hücrelerde salınımı teşvik ne bir titiz değerlendirme için kapıyı açar, ve bu tür moleküller arasındaki etkileşimi test etmek. Elinde Bu araçları ile, biz hedefliyoruzBütün embriyo test edilebilir tahminler üretmek için tek bir hücre içinde yayınlanan doku düzey veri yanı sıra, kullanım sonuçlarına dayalı somitogenesis mevcut modellerini değerlendirir.
Bildiğimiz kadarıyla, bu tek hücre floresan akut time-lapse kayıt için ilk Zebrafish birincil hücre kültürü protokolü; Bu protokolün daha da geliştirilmesi ve arıtma mümkün kuşkusuz. Diğer protokoller genellikle muhabir ile transfekte edilmiş ve uzun süreli görüntüleme 27-29 için kullanılabilecek kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için zebra balığı embriyolar kullanın. Kararlı çizgiler gibi sirkadiyen saati geliştirme zamanlaması, bağlı olmayan bir süreç görüntüleme için yararlı olmakla birlikte, hücreler salınımlı, öncül devlet hala iken, embriyonik segmentasyon soru acil görüntüleme gerektirir. Hücreler salınan durdurmak sonra, onlar dokuda, bir hücre gruplarının dahil olacağını zaman bir farklılaşmış hücre kaderi varsayalım, ve. Bu poDoğru faktörü veya in vitro olarak mevcut faktörler ile önemli ölçüde daha uzun vadeli gözlemler, birden çok ardışık bozulmaları, ya da yüksek verimli tarama sağlayan titreşimli kalacağını PSM-benzeri zebra balığı hücre kültür hatları oluşturmak olabilir ssible.
Biz zaman atlamalı görüntüleme için dağılmış hücrelerden primer kültürü hazırlama, bu yöntem kararlı Zebrafish hücre hatları kullanılarak ulaşılabilir değildir gelişimsel bir zaman dilimi içinde meydana gelen herhangi bir hücresel sürecin çalışması için çok uygun olduğunu düşünüyoruz. Diseksiyon ile veya FACS ile ya da uygun bir transgenik raportör hatlardan farklı gelişim aşamalarında farklı hücre tiplerinin izolasyonu embriyonik ayrıldıktan sonra, başlangıç hücreleri sağlayabilir. Hücrelerin embriyo tarafından yönlendirilen kültür koşulları, bazı optimizasyonu, gerekli olabilir. Transgenik zebrafish hızla büyüyen koleksiyonu ile bu esnek ve hassas protokol birleştirerekçizgiler, biz klasik genetik ve embriyolojik yöntemlere tamamlayıcı olan bir in vitro gelişim biyoloji yaklaşımı kolaylaştırmak istedik.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, bir EMBO Uzun süreli araştırma bursu (ABW) tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı Uluslararası Doktora Sonrası Araştırma Bursu (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), bir kazılar-BB bursu (AO), ve (ACO DS) Avrupa Toplulukları Yedinci Çerçeve Programı STG-207634 altında Avrupa Araştırma Konseyi. Biz yazının yararlı yorumlar için Ravi Desai teşekkür ederim. Biz de Zebra balığı Fibronectin1 fragmanı, bakım ve bizim balık hatları ve görüntüleme desteği için MPI-CBG ışık mikroskobu tesisin bakımı için MPI-CBG balık tesisi personelinin üretimi için MPI-CBG protein ekspresyon tesis teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P. Quantitative approaches in developmental biology. Nat Rev Genet. 10, 517-530 (2009).
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo’s Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237, 545-553 (2008).
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Methods in molecular biology. 546, 153-172 (2009).
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (1126).
