シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

1。解剖の前に解剖前日に、トランスジェニック対立遺伝子に関してヘテロゼブラフィッシュのペアのインクロスから胚を得る。 シールド段階（6時間受精後）まで、28 O CでのメチレンブルーずにE3培地中で胚を上げる。 20 O、CO / NにメチレンブルーのないE3培地で移植胚彼らは尾芽段階に達すると20 度Cで、胚は、時間ごとに1体節を形成することになる。 20 O Cでの17〜20時間、O / N後、胚を解剖プロトコルの先頭に次の朝、ステージ5から8体節にあるべきである。 解剖のために必要なツールおよび試薬を組み立てます。 胚および組織の移転のためのファイアーポリッシュガラスピペット胚から絨毛膜を除去するための細かいピンセット解剖用SYLGARDでコーティングされた35-mmディッシュ – 35ミリメートル皿にシルガードポリマーを注ぎ、37℃でO / Nを治す使ってよく解剖をする硬化したポリマーの小さなボリュームを削除し、針の先端。皿を洗浄し、続いて再利用することができる。 PSMの組織操作のための先鋭化、フラット化タングステン線ツール文化にPSMの所望の部分を切断するためのマイクロ手術用メストリプシンインキュベーションのための35mmのプラスチックシャーレ 10％ウシ胎児血清を含むL15培地 0.25％トリプシン/ EDTA溶液分散のためのSigmacotedゲルロ​​ーディングのヒントメチレンブルーずにE3培地を含むプラスチックペトリ皿。 Fibronectin1基板（PBS中10μg/ mlの）とグラスボトムイメージング料理をカバーしています。解剖時にコーティングするためにベンチで料理をしておきます。 識別するために、適切な蛍光フィルターとソート正トランスジェニック胚（5から8体節期）とステレオスコープを使用してください。 蛍光チャンネル（ 図1A）の下で、YFPの発現前体節中胚葉（PSM）を調べることによって、トランスジェニック胚を特定します。蛍光翔ULDは尾芽の最後に形成された体節の領域に見えるように。最も明るい信号に胚を選択します。子孫の25％が導入遺伝子の2コピーを有するホモ接合胚である必要があります。必要に応じて特定された胚の数は、実験に基づいて変化します。一解剖し尾芽胚ピースは、平均して、1,000個の細胞が得られます。一般的には、いくつかの追加の正の胚は、解剖中に行われた場合のエラーが発生するのに有用である。 信号から、特に卵黄細胞において、任意の自己蛍光を区別するために、位置基準として透過光を使用する。 メチレンブルーずにE3培地を含む別々のプラスチックシャーレに正の胚を転送します。 2。PSM切開および散布解剖のための胚を準備します。 解剖顕微鏡下で、細かい鉗子を使用して、慎重にE3培地に各胚から絨毛膜を除去します。胚に損傷を与えたり、卵黄細胞を破壊しないように注意してください。 </lI> 血清を含むL15培地でのSylgardでコーティングされた解剖皿に入れます。鉗子または他の平らなツールを使用して、シルガードの表面から気泡を除去する。 解剖皿にファイアーポリッシュガラスピペットを使用して絨毛膜を除去した胚を転送します。 ワイヤーツールを使用して、解剖皿の片側にすべての胚を移動します。 シングル胚からPSMを解剖。 オリエントよく解剖皿（ 図1B）内のSylgard層で行われた小さなその横側に、単一の胚。 マイクロメスを用いて、単に後脳に、胚の腹側の極（ 図1B、赤い点線）を介して前方胚および卵黄細胞をスライス。 皿の側にそれを離れて移動し、井戸から胚の前方部分を削除してから、PSMなどの後方部分から離れて、残りの卵黄細胞の顆粒をこすり、ワイヤツールを使用しています。 卵黄が削り取られた後、平らにし、離れて、実験者から向いて前方端とのPSMおよび実験（ 図1C）の方を向いて後方に向けます。 外胚葉の薄い層が、この時点ではオフに引っ張られていない場合は、離れてPSM組織の上からそれを剥離する線ツールを使用しています。 マイクロメスを使用すると、離れた組織の他の部分（ 図1C、赤い点線）から、脊索の終端を越えて尾芽胚、PSMの最も後方の先端を切った。注：PSMからの組織の他の部分は、最後に形成された体節に近い例前方PSMのために、また、実験的な質問に応じて、文化に撮影することができます。 離れて解剖エリアから皿の1コーナーに尾芽胚ピースを移動します。解剖フィールドからごみや不要な胚組織をクリアするために、ワイヤ·ツールを使用してください。 次の胚を繰り返します。 プールは、複数の電子からの作品を尾芽胚mbryos、実験に必要とされるセルの数によって異なります。平均して、尾芽胚組織の一枚は、1,000個の細胞が得られます。 トリプシン-EDTA少量の空の35 mmのプラスチック製の皿を埋める。 ファイアーポリッシュガラスピペットを使用して、トリプシン/ EDTAを含む皿に料理を解剖から尾芽胚曲を転送します。 RTで20分間、トリプシン/ EDTAで尾芽片をインキュベートする。 組織は、トリプシン中でインキュベートされている間に、ガラス底のイメージング皿からFibronectin1溶液を除去。 ミリQ水でガラスから3回のソリューションを洗浄します。各洗浄を削除し、料理は完全に乾燥していることを確認するために吸引を使用してください。 イメージング用培地で尾芽胚片を分散させる。 イメージング皿に血清をL15培地100μlをピペットで。 コー​​ティングされたゲルの先端を使用して、可能な限り少量のトリプシン/ EDTAから尾芽胚片を取り除く。 培地中に尾芽胚片をピペットイメージング一品。それらを分割し、培地中で細胞を懸濁するために上下に複数回の部分をピペット。気泡を導入しないように注意してください。顕微鏡下で細胞塊を確認し、必要に応じてより多くを分散させる。 懸濁液中の分散した細胞を、室温で20分間Fibronectin1コーティングガラス上に沈降させる。 イメージングを開始する前に、細胞に血清を追加L15培地を少量を追加します。落ち着いた細胞を破壊しないように注意して使用してください。 実験の質問を考えると、文化に任意の補足的または薬物治療を追加します。 分散PSM細胞の3。イメージングタイムラプスイメージング顕微鏡で恒温槽内イメージングの皿を設定します。実験のために所望の温度にワーナー室を設定します。料理は、画像取得を開始する前に、少なくとも30分間平衡化することができます。必要であれば外部温度プローブとクロスチェック温度は、皿に入れた。注：ために温度や体節形成率21安定した温度制御との関係は、単一のPSM細胞における期間の正確な測定のために不可欠です。 露光時間と利得が雑音レベルに良好な信号を確保するために、飽和することなく、強度の大きなダイナミックレンジを提供することを確認するために蛍光チャンネルにおけるテスト画像を取得する。このプロトコルを使用して私たちのラインから生成され分散した細胞から得られた典型的な蛍光画像は、85のEMゲインで動作EMCCDカメラで透過光画像用の400ミリと40ミリ秒を必要としますから、また、プリアンプ·ゲインと読み出し速度カメラはノイズで信号を最大化するために不可欠である。 透過光チャネルを使用して、タイムラプス取得のための細胞のフィールドを選択します。 所望の時間のために、タイムラプス取得プロトコルを実行します。 1透過光と、フィールドごとに1つの蛍光画像を取得。注：取得ROの間隔を設定します。拡張された画像の上に、光退色や細胞内で毒性を誘発することなく、時間的なダイナミクスをキャプチャしますunds。このプロトコルは、2分間隔を使用しています。 細胞は、ソフトウェアやハードウェアのエラーなど焦点に残ることを保証するために、記録中に時折タイムラプスセットアップをチェックしてください取得した時間経過の映画の4の画像処理開いた動画像処理ソフトで取得したフィールドのファイル。 NOTE：フィジーは、このプロトコルの全ての処理のために使用した。 画像の2スタックを作成するために1フィールドからの透過光と蛍光のフレームを分割します。 透過光チャネル内の単一のセルを追跡します。 透過光チャネルの最初のフレームで選択したセルの周囲に円形のROI（関心領域）を配置します。注：1録画終了時に健康な細胞のみ、2は、フィールドの外に移動しない、および3は、他のCEと接触しない。LLSは、追跡される。 ROIのROIマネージャーに数フレームごとに保存します。最後のフレームまでのセルを追跡します。 蛍光チャンネルに保存されたROIを使用して強度を測定する。 蛍光スタックを選択し、保存された関心領域を、時間をかけて追跡し、細胞の強度を測定するためのカスタム·サークル補間プラグインとマクロを使用します。 マクロからの出力トレースを確認してください。トレースは定性的蛍光タイムラプスの特徴を捉えた場合、Excelのワークシートに値をエクスポートします。 セルのためのROIリストを保存します。 送信されたチャネルで追跡し、フィールド内の他のセルの蛍光チャネルで測定を繰り返します。 実験からの追加フィールドのすべての手順を繰り返します。