الدجاج الأجنة شريحة الحبل الشوكي الثقافة البروتوكول
Summary
الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين بواسطة الجينات والاضطرابات الدوائية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن ظروف ثقافة التطور الطبيعي يمكن المضي قدما في خفض البيئة من شريحة. نحن توضيح البروتوكول الذي يسهل التطور الطبيعي الحبل الشوكي على المضي قدما لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
Abstract
يمكن الثقافات شريحة تسهيل التلاعب تطور الجنين على حد سواء من خلال التلاعب عقاقيري والجينات. في هذا النظام انخفاض، يمكن التغلب على الآثار الجانبية المحتملة القاتلة بسبب المخدرات التطبيقات النظامية. ومع ذلك، يجب التأكد من أن الظروف الثقافة عائدات التطور الطبيعي ضمن بيئة مصغرة من شريحة. فقد ركزنا على تطوير الحبل الشوكي، وبخاصة أن الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. نحن تباينت الظروف بصورة منهجية ثقافة شرائح الدجاج الجنين من النقطة التي ولدت معظم الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري. نحن يعاير عدد ونوع الخلايا العصبية الحركية التي نجت خلال الفترة الثقافة والموقف من تلك الخلايا العصبية الحركية مقارنة بما كان عليه في الجسم الحي. وجدنا أن هناك حاجة إلى نوع المصل وعوامل عصبية خلال الفترة الثقافة وكانت قادرة على الحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة لمدة لا تقل عن 24 ساعة والسماح تلك الخلايا العصبية الحركية للهجرة إلى المواقف المناسبة فيالحبل الشوكي. نقدم هذه الظروف الثقافة ومنهجية إعداد الثقافات شريحة الجنين باستخدام أجنة الدجاج ينتزع منه جزءا لا يتجزأ من الاغاروز وشرائح باستخدام vibratome.
Introduction
خلال تطور الجنين الطبيعي، يتم إنشاء العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي يجب أن تهاجر من نقطة انطلاقها إلى حيث ستعمل في نهاية المطاف في الكائن الحي ناضجة. داخل الحبل الشوكي النامي، وتقع الخلايا الاصلية في منطقة البطين في خط الوسط وتوليد أنواع فرعية عديدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية تالية للتفتل التي يجب أن تهاجر إلى الاندماج في دوائر الخلايا العصبية الوظيفية اللازمة لمعالجة الحسية الحركية والمخرجات 1. وقد الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري التي تتحكم في انقباض عضلات الأطراف درس على نطاق واسع وكما هو معروف الكثير من الجزيئات والآليات التي تدفع تشكيل الفئات الفرعية المختلفة. ومع ذلك، فمن المعروف أقل بكثير من الآليات التي تهاجر الخلايا العصبية الحركية، وتلقي المدخلات فصل متشابك.
ويكتسب هوية النوع الفرعي للسيارات خلال الخلايا العصبية التنمية بطريقة هرمية. ويمكن للسيارات فرعية تصنف الخلايا العصبية على نطاق واسع طn لأعمدة متميزة، والانقسامات التي تعرف تجمعات من محور عصبي التوقعات الخاصة بهم. أعمدة المحرك محاور عصبية المشروع إما إلى العضلات، أو أطرافهم المحوري الحشوية. الانقسامات السيارات تقسيم الطرف إسقاط الخلايا العصبية الحركية في العمود الجانبي للسيارات (LMC) في تلك العضلات البطنية لإسقاط أو الظهرية 2. الانقسامات داخل، ووصف مجموعات من الخلايا العصبية الحركية موتور برك مشروع لعضلات الفرد في الطرف 2 و 3. وتعرف الخلايا العصبية الحركية من قبل الأطراف الاصطناعية إسقاط التعبير عنها من عامل النسخ Foxp1 4، 5، في حين يتميز هوية الشعب من التعبير عن عوامل النسخ homeodomain جزيرة-1 (إسقاط بطنيا) أو LHX 1-(إسقاط ظهريا) 6. في الواقع، هناك حاجة LHX-1 التعبير عن التوقعات في ظهري المناسب من الخلايا العصبية الحركية 7. كل من هذه الأنواع الفرعية يشغلون مناصب متميزة داخل الحبل الشوكي؛ بطني الخلايا العصبية الحركية إسقاط تأتي للإقامة الإنسي إلى projecti ظهريانانوغرام الخلايا العصبية الحركية. يتم فصل هذه النتائج في LMC في LMCmedial ما يسمى (LMCm) والانقسامات LMClateral (LMCl). ويكتسب الشعب وتنظيم تجمع السيارات على مرحلتين 8. في المرحلة الأولى، يتم تحقيق العزل الشعب عن طريق الهجرة من الخلايا العصبية الحركية في صفة الإنسي إلى الوحشي الأزياء. يتم إنشاء خلايا LMCl بعد ذلك الخلايا LMCm وLMCl يهاجر من خلال LMCm لتحقيق تسوية موقفها النهائي. المرحلة الثانية تستغرق الخلايا العصبية الحركية داخل الانقسام ومجموعات منهم إلى برك الخلايا العصبية الحركية، ويفترض من خلال الفرز الظهري البطني من الخلايا العصبية الحركية. وقد ثبت أفراد الأسرة catenin التي تعتمد على كادهيرين الكلاسيكية تكتسي أهمية بالغة لكلتا المرحلتين من 8-10 موتور تنظيم الخلايا العصبية. ولكن، كيف يتحكم في حركة كادهيرين ظيفة الخلية ما زال يجهل الكثير.
الحصول على هويات عمودي، وتجمع الشعب يتطلب إشارات خارجي هذا النمط intrinsiج التعبير عن عوامل النسخ 11. بالإضافة إلى ذلك، حوالي 50٪ من جميع الخلايا العصبية الحركية عن طريق موت الخلايا المبرمج خلال يموت التطور الطبيعي في عملية تتطلب إشارات خارجي من أطرافه، إلى حد كبير من خلال تقديم الدعم للبقاء عصبية الخلايا العصبية الحركية. وهكذا، الخلايا العصبية الحركية التنمية يتطلب بيئة مناسبة ليتم الحفاظ على مدى timecourse طويلة نسبيا. لهذا السبب، فإن العملية لتوليد الشوكي الثقافات شريحة الحبل للحفاظ على بقاء الخلايا العصبية الحركية تتطلب الكشف عن ظروف التربية المناسبة. وقد استخدمت الثقافات السابقة شريحة الجنين لمتابعة سلوك وأضاف السكان خارجيا تنقية الخلايا العصبية 12-14. ومع ذلك، لدينا ظروف ثقافة المعرفة التي تسهل البقاء على قيد الحياة في الموقع الخلايا العصبية الحركية والهجرة داخل شريحة نفسها لم تنشر. نحن تعديل شرط القياسية التي تسهل الثقافة بقاء تنقيته، فصل الخلايا العصبية الحركية الجمجمة لتسهيل مأذني الخلايا العصبية التنمية داخل ثقافة النظام الجنين شريحة. ونحن أيضا رصد المواقع من الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة وإثبات أن يكتسب المواقف العادية إلى حد كبير من الشعب الخلايا العصبية الحركية خلال الفترة الثقافة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يسمح حضنت الأجنة شريحة الدجاج لأكثر من يوم واحد مع إبقاء الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة والاستمرار في ترحيل خلال الفترة الثقافة. في توضيح الظروف للحفاظ على الخلايا العصبية الحركية على قيد الحياة، لقد حددنا عدة الملامح الرئيسية المطلوبة. يبدو أن ما يصل إلى 4٪ فرخ المصل أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلايا العصبية الحركية والاستعاضة عنها مصل من الأنواع المختلفة والتسامح لا. ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن وجود تركيزات أعلى من المصل لها أثر ضار على شرائح كما روجت فرط نمو الأنسجة مما يؤدي إلى تشوهات جسيمة في شكل شريحة. والأهم من ذلك وجود عامل التغذية العصبية cilliary ثبت أيضا حرجة. يبقى احتمالا واضحا أن شرائح قد تكون قادرة على أن تكون مثقف لفترات أطول بكثير من مجرد 24 ساعة، وربما السماح حتى التصور للمدخلات الحسية وارد إلى الحبل الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، طريق مسدودالشروط والأحكام قد تلح هنا يكون مفيدا أيضا لشريحة الثقافات من الدماغ النامية والمخ الأوسط / المخيخ.
ولعل أكبر فائدة محتملة في استخدام هذه الشروط ثقافة شريحة هي أنها تسهل إمكانية للتلاعب الدوائية للوظيفة البروتين في حين التقليل من احتمال حدوث آثار سلبية على بقية الجنين، مثل القلب. ويمكن استخدام عدد كبير من مثبطات ومنبهات مختلفة من مسارات إشارات لتقييم هجرة الخلايا العصبية في العمود الفقري مختلفة الأنواع الفرعية، وربما تأثيرها في تشكيل الدوائر المحلية الشوكي خلال التنمية. بالإضافة إلى ذلك، بعض الاضطرابات الوراثية التعبير البروتين، مثل تلك التي تستخدم siRNAs وأليغنوكليوتيد] morpholino، يعانون من حقيقة أنه لا يمكن أن تكون أدخلت في وقت مبكر من التنمية (بسبب القيود في الإجراءات الصعق الكهربائي في البيضة) وآثار الماضي فقط ل فترة قصيرة من تيمه (عادة يوم واحد). بدء ثقافتنا شريحة في مراحل لاحقة ويتيح إمكانية استخدام هذه التكنولوجيا في وقت لاحق في التنمية في مرحلة تشريح لعرض آثارها خلال الفترة من ثقافة شريحة.
يمكن للبروتوكول ثقافة شريحة تسمح أيضا تصور كل من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الظهري وكذلك الهجرة عصبون في الوقت الحقيقي عن طريق الفحص المجهري الفيديو في الوقت الفاصل بين. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام المجهر النقيض من المرحلة تحت الضوء الأبيض أو من خلال استخدام التصوير مضان. إذا كان الأسلوب الأخير كان من المقرر أن تستخدم بعد ذلك هناك حاجة إلى إدخال علامات الفلورسنت. ويمكن تحقيق ذلك إما عن طريق إدخال الأصباغ الفلورية مثل مبادرة ديزرتك الصناعية أو إما عن طريق وضع العلامات ديو الوراء من الطرف أو وضع العلامات تقدمي من البطين أو الصعق الكهربائي في البيضة من يبني البروتينات الفلورية لدفع في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر شارون المفخرة للمناقشات كثيرة وبصيرة Novitch B. هدية لنوع من الأجسام المضادة لFoxp1. هذا العمل الممول من منحة دراسية لمن ويلكوم ترست لKCT ومنحة المشروع من ويلكوم ترست لSRP (المنح إشارة 094399/B/10/Z رقم).
Materials
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. 발생학. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K., Bronner-Fraser, M. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. 87, 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
