单个锥体神经元的高保真光遗传学控制方法<em>在体内</em

1。病毒贮藏和准备为提供视蛋白基因的啮齿动物的大脑使用无法复制的AAV载体已被批准用于生物安全1级（BSL-1），并要求在美国政府刊物，在生物安全微生物和生物医学实验室，可在概述了适当的保护和处理程序在疾病控制中心网站（ http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ）。 为了避免反复冻融，吸管病毒从制造商的小瓶成更小的分装在II级生物安全柜，存放于-80℃冰箱。 此前立体定向注入，让等分在冰上融化，然后简要降速与台式离心机。 慢慢回填一个汉密尔顿玻璃注射器和针头用少量的有机硅或矿物油。确保没有明显的气泡在注射器针筒。将注射器插入一个微量泵直接安装在泵的垂直立体定位臂（ 即立体机械手）。 降低立体定位臂，直到针的尖端接触到病毒的等分试样管的底部。使用控制器的微量泵撤回病毒的所希望的体积（1.5微升的1微升注射）。 所有的材料和表面，它们与病毒接触，应进行净化与消毒，如含氯漂白剂（10％）。 2。手术和病毒注射液麻醉动物用氯胺酮（大鼠，125毫克/千克，IP） – 甲苯噻嗪（大鼠，10毫克/千克，IP）的鸡尾酒。为了衡量麻醉效果，检查到脚趾捏反射反应，并根据需要给予补充剂量的氯胺酮。使用标准的无菌手术方法，将动物变成立体定位仪（大卫科夫在剂量率仪）。 通过对动物头骨手术小剪刀或手术刀上方的皮肤作正中切口。轻轻分开结缔组织及清洁用小刮刀骨颅骨的顶部。 验证动物的头是水平的，这样的Z坐标为前囟和lambda是相等的。确定立体坐标从一个脑图谱如鼠脑立体坐标 （乔治·旅游Paxinos和查尔斯·沃森，科学出版社，2007）或小鼠大脑中的立体坐标 （基思·北京·富兰克林和乔治·旅游Paxinos，学术出版社的目标脑区，2007）。标记注入的预期部位与手术的笔。 仔细薄颅骨比使用一个手持电钻目标区域并且当钻头到达头骨底部停止。使用一对额外的细镊子，取出以露出硬脑膜变薄的骨头。 定位注射器针头在目标是一，降低针，直到它触及硬脑膜，用这点来计算的z坐标。非常缓慢地降低注射针入脑，直到正确的Z位置为止。在这个协议中，内侧前额叶皮质的前度区域（2.7毫米前到前囟，±0.5毫米横向中线和-2.2毫米从硬脑膜）或背侧下脚（-6.0毫米到前囟，±3.0毫米横向中线和-2.0毫米硬脑膜）是针对一个成年SD雄性大鼠（约275克）中。 注射病毒以0.1微升/分钟的速率。注射完成后，等待10分钟，抽出针头，以避免病毒的倒流到大脑表面之前。 用缝纫机缝合用针连接，以密封在皮肤和应用的抗生素与伤口。 的ChR2和NpHR从AAV载体功能性表达的时间过程将取决于实验设计和病毒滴度变化。在这个实验中， 在体内 </eM>录音被进行18-21天注射后。 3。光传输和在 ChR2的或NpHR表达神经元在体内录音连接的钨电极（〜1-1.5MΩ，微探针）使用强力胶的玻璃毛细管（Fisher科学）。 使用光纤剥线工具（Thorlabs公司）公开一个多模光纤（直径200微米的核心，Thorlabs公司）和清洁光纤头与乙醇的裸结束。很轻易得分光纤头与一个楔形钻石刀（Thorlabs公司），并小心地除去多余的纤维（ 如用细镊子）。光纤应在比分轻​​松切割。 光纤的FC端连接到一个200毫瓦单个二极管激光（输出端口上的PC连接器www.Lumiphy.com ）与所期望的波长。确保与激光器工作时，合适的保护眼罩戴在任何时候。 测量L阿塞尔强度在光纤的使用光功率计（尖端www.Lumiphy.com ）。 在体内录音，光照强度少则20-100毫瓦/毫米2能可靠地唤起神经元活动的ChR2或NpHR介导的激活或沉默，分别。 插入所述光纤插入毛细管。定位在纤维末端的钨电极的尖端约500微米以上而配合的薄缝合线两次在尖端附近的几个点，使得所述电极和所述纤维是直的。确保电极的尖端和最近的结之间的距离足够长，用于插入到目标区域。 准备动物如步骤2.1和2.2以上。使用初始开颅手术为指导，以使一个新的干净的小窗口，在颅骨的定位optrode（ www.Lumiphy.com ）。使在D小切口市建局使用细针。 通过头骨的窗口和进入大脑小心地将optrode用显微操作（成茂）的转区。然后推进optrode慢慢在10-50微米的步骤，直到一个光响应性细胞的出现。 自定义软件的用户界面（NeuroLux临www.Lumiphy.com ）LabVIEW编写的（美国国家仪器）是用来控制单个二极管激光器和可视化和记录持续的神经活动。记录的信号被捕获与ExAmp-20K（Kation Scientific）的放大器的带通滤波（0.3-8千赫），和National Instruments的模拟到数字板（NI USB-6009）。该NeuroLux专业用户界面允许模拟输入的选择（选择两个通道的神经元和TTL信号）和数字输出。用户可以定义采样率（20千赫），基线期（预光），和后期的光周期。用户可以定义中的TTL激光stimulati上的脉冲宽度，频率和刺激期间（如果频率是20赫兹和刺激期间是500毫秒，10的激光脉冲与定义脉冲宽度交付）。用户也可以选择连续光传输（ 例如 ， 图1）。为重复的记录，用户还可以定义脉冲串的数目和列车之间的间隔。数据可以有或没有记录到磁盘被收购。 以下记录，将动物麻醉，用氯胺酮/赛拉嗪混合物和以验证optrode安置和视蛋白表达心脏灌注生理盐水和多聚甲醛（4％）。