Разработка и использование Мультиплексированный массивы хемостата
Summary
Мы разработаны и утверждены компактных массива миниатюрных хемостаты построены из легко доступных частей для низкой стоимости. Физиологические и экспериментальные результаты эволюции были похожи на большие хемостаты объеме. Массив Ministat обеспечивает компактную, недорогую и доступную платформу для традиционных экспериментов хемостат, функциональной геномики и приложения химического скрининга.
Abstract
Хемостаты непрерывных систем культуры, в которой клетки выращивают в жестко контролируемой, химически постоянной среде, где культура плотностью ограничен предельным конкретных питательных веществ. 1,2 Данные хемостаты являются высокая воспроизводимость для измерения количественных фенотипов, поскольку они обеспечивают постоянную скорость роста и окружающей среде в стационарном состоянии. По этим причинам, хемостаты стали полезным инструментом для мелкомасштабных характеристик физиологию через анализ экспрессии генов 3-6 и другие характеристики культуры в стационарном состоянии равновесия. 7 Долгосрочные эксперименты в хемостаты можно выделить конкретные траектории, микробных популяций принять в процессе адаптивной эволюции в контролируемой среде. В самом деле, хемостаты были использованы для экспериментальной эволюции с момента их изобретения. 8 общий результат эволюции экспериментов для каждой биологической повторных приобрести уникальный репертуар мутации. 9-13 Такое разнообразие позволяет предположить, что еще есть много предстоит открыть, выполнив эволюции эксперименты с гораздо большей пропускной способностью.
Мы приведем здесь проектирования и эксплуатации относительно простых, низкая стоимость массив миниатюрных хемостаты или ministats и проверки их использование в определении физиологии и эволюции эксперименты с дрожжами. Такой подход влечет за собой рост десятков хемостаты работать от одного мультиплексированных перистальтического насоса. Культур поддерживается на уровне 20 мл рабочего объема, что является практичным для различных приложений. Мы надеемся, что увеличение пропускной способности, снижения расходов и предоставления подробной строительства и эксплуатации инструкции могут также стимулировать научные исследования и промышленного применения этой конструкции в качестве общей платформы для функционально характеризующих большого числа штаммов, видов и параметров роста, а также генетические или библиотек наркотиков.
Introduction
Динамика микробного роста и развития являются основополагающими для микробиологии, экологии, генетики и биотехнологии. Наиболее распространенный метод культивирования микроорганизмов в партии, где клетки засевают при низкой плотности в богатой питательными веществами бульон и выращивали до насыщения. Хотя несложно выполнить с помощью стандартного лабораторного оборудования, партия культур испытывают колебания химической среде и, соответственно, изменения клеточной физиологии. Это гетерогенной среде роста может привести к вторичные эффекты роста и стрессов, которые могут маскировать тонкие физиологические различия. Экспериментальные эволюции последовательной передачи партия может выбрать для сложных смесей роста фазы конкретные субпопуляции, что усложняет попытки связать адаптации к конкретным селективных условиях. Измерение количественных фенотипов может быть затруднено из-за шума от неточного времени выборки и изменения функций, таких как временным лагом. Непрерывные культуры обеспечивают альтернативуРост режим, при котором клетки могут быть воспроизводимо выращивают в химически однородной среды на определенный темп роста для достижения физиологического устойчивом состоянии. Благодаря этим преимуществам, исследования экспериментальной эволюции и характеристики сотового состояния часто используют контролируемой среды непрерывного культур, как хемостат 14.
Оценка этих преимуществ привело к возрождению интереса к хемостат культур 15. С момента их появления в 1950 году, 1,2 хемостат системы были разработаны для функционирования на различных масштабах от литра до мкл и для различных приложений 16. -19 Эти различные конструкции, которые варьируются от серийно выпускаемых биореакторов для glassblown судов пользовательских платформ микрофлюидики, доля общих принципах дизайна. Культура камеры перемешивают и газированные (как правило, путем пропускания воздуха через него) и микробов содержащихся в нем хранятся однородныеют рассеяны по всему культуры камеру во все времена. Свежий среде определенного состава добавляется постоянно и скорость добавления контролирует темп роста и влияет на химические среды, испытываемых культуры. Переполнение задает культура объем в росте трубку, и через это переполнение культуры будут взяты образцы с той же скоростью, при которой свежей среды входит. Таким образом культурами быстро добраться до физиологической устойчивое состояние, при котором многие биологические параметры остаются неизменными. Несмотря на преимущества хемостаты и отчеты об этих различных платформах в литературе, широкое распространение было ограничено трудности в строительстве и эксплуатации этих систем, и высокие расходы, связанные с коммерческой вариантов. Кроме описания того, как создавать и использовать эти устройства могут быть непрозрачными.
Мы представляем образцы и инструкции по применению компактных массива миниатюрных хемостаты построены из легко доступных частей по низким ценам. Мы наблЭрве весьма последовательно экспериментальные параметры и воспроизводимые результаты при сравнении наших устройство представила данные за дрожжи культивировали в большем объеме коммерческие биореакторы. Это включает в себя воспроизводимость клеточной физиологии, как видно по достижении стационарного равновесия в течение 10-15 поколений и получения аналогичных плотности культуры в равновесии. Кроме того, модели экспрессии гена согласуются между ministats и коммерческих большего объема платформы. Устойчивость разбавления, оптической плотности и воспроизводимость экспрессии генов между тремя повторных культур продемонстрировать надежность нашей платформе. Мы также показываем, что же адаптивные мутации возникают по сравнению с аналогичными сроками экспериментальной эволюции как с большим объемом хемостаты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хемостата выращивания в ministats, как с любым хемостат, требует внимания к деталям и устранения неисправностей. Поскольку загрязнение вызывает большое беспокойство в непрерывных экспериментов культуру, мы обычно смотрят через микроскоп для бактериальные и грибковые загрязнения на прививки и каждые 50 поколений в течение длительных экспериментов эволюции. На сегодняшний день мы не наблюдали загрязнения через 96 экспериментов эволюции более 300 поколений (данные не показаны). Для проверки перекрестного загрязнения между ministats и потенциал для микробов, чтобы колонизировать культуры камере путем канализационная линия мы провели 16 ministats такие, что любой другой Ministat инокулировали дрожжей, как указано выше, а остальное не засевают любой культуры. Культуры были отобраны в коммунальную контейнер, который был освобожден через день. Таким образом, если бы это было возможно для загрязнителей войти через канализационная линия, мы вероятно бы отметить, что в этом experimENT. В течение трех недель и больше, чем 100 поколений роста в этом шахматном порядке привитых и не прививку культуры мы не наблюдаем рост в не привитый труб Ministat культуры, предполагая, что загрязнение от внешних дрожжей или другие микробы вряд ли произойдет в экспериментах Похожие сроки.
Несмотря на то, ministats были предназначены для работы в моде аналогичных коммерческих хемостаты, модульная природа этого механизма позволяет оптимизацию в соответствии с потребностями пользователей и бюджет. Перистальтический насос, используемый в данном протоколе можно добиться расхода между 0,0186 об / час до 3,6 т. / ч (данные не представлены). Повышенный контроль разведение ставки могут быть достигнуты с альтернативными моделями насосов. Обратите внимание, что операции по более низким ставкам разбавления может потребовать замены высших иглы для достижения той же частоте капли доставки. Численность населения является важным фактором для правильного дизайна эволюции экспериментов.Стандартная ставка разведения и концентрации питательных веществ, используемые здесь обеспечивает относительно большой численностью населения (~ 10 9 клеток) того же порядка, что и опубликованные исследования эволюции 11. Большего или меньшего населения может быть сохранена путем изменения рабочего объема или ограничение концентрации питательных веществ. Увеличение мутации питания также может быть получен путем работы с штаммы с повышенной цены мутации.
Ministats также может быть улучшен по сравнению с нынешней конструкции. Например конденсации может собрать на стенах культуры трубки и может быть значительно снижена при использовании глубокий водяной бане, инкубатор, или постоянной комнатной температуры. Хотя слипания и стены рост сульфата ограниченной культур представляется относительно редки, появляясь в 5/48 экспериментов эволюции на 300 поколений (данные не представлены), различные поверхностно-активные вещества имеются, которые могут помочь в уменьшении или задержку эту черту. В случае, если слипания мешает адекватной культурысмешивания, повышенное волнение может быть достигнута за счет сокращения числа способов каждого воздушного насоса разделен, либо путем добавления перемешивание аппарата. Дополнительные зонды для растворенного газа концентрации, рН, или другие параметры могут быть также включены, как и в некоторых других конструкций 17.
Несмотря на потенциальные изменения, используя ministats, как описано в этом протоколе, мы наблюдали очень последовательно экспериментальные параметры и воспроизводимые результаты при сравнении наших устройство представила данные за больший объем коммерческих хемостаты. Это включает воспроизводимость клеточной физиологии, как видно по достижении стационарного равновесия в течение 10-15 поколений (рис. 2A) и получения аналогичных плотности культуры в равновесии. Моделей экспрессии генов были последовательны в трех биологических размножается в ministats и между ministats и коммерческих большим объемом платформы (рис. 2В), за исключением генов метаболизма железа. Эти ехрression различия, вероятно, вызвана изменениями в содержании металла из двух устройств или улучшения качества компонентов среды. Наши данные показывают, что ministats будет полезна для физиологии или конкуренции эксперименты, в которых последовательно окружающей среды не требуется.
Чтобы проверить, если дизайн Ministat достаточно для экспериментальных приложений эволюции мы развивались культур под сульфат ограничение на 250 поколений и использоваться CGH для характеристики усиления в локусе SUL1 -. Отличительной чертой долгосрочного развития в этих условиях в большей хемостаты объемом 10 мы наблюдали Усиление SUL1 в клонах от 4/4 независимых экспериментов эволюции в сульфат-ограниченных средах (рис. 2С). В целом эти данные свидетельствуют о том, что ministats являются надежной платформой, которая может быть полезна для различных традиционных приложений хемостат. Хотя мы продемонстрировали их использование в культивировании почкующихся дрожжей, ministats должнытакже совместимы с другими организмами и аналогичных конструкций на самом деле были использованы для культивирования бактерий и других видов дрожжей. 16,17,25 Кроме того, меньший объем культуры и коррелирует снижение потребности в средствах массовой информации может сделать ministats привлекательной альтернативой для экспериментов, требующих дорогих или экзотических реагентами, как может быть в случае химической или генетической экранов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Создание видео было поддержано грантами от Национального научно-исследовательский центр ресурсов (5P41RR011823-17) и Национального института общих медицинских наук (8 GM103533 P41-17) из Национального института здоровья. Эта работа была также поддержана грантом NSF 1120425. MJD является Rita Allen Foundation Scholar. AWM будет частично поддержана NIH T32 HG00035. Мы благодарим Анну Саншайн за помощь в улучшении протоколов. Кроме того, мы признаем, Сара DiRienzi, Селия Payen, и Эми Сирр в качестве первых пользователей ministats.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| 1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| 1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
| Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
| Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
| Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
| Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
| Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
| Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
| Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
| Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
| Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
| Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
| PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
| 1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
| #8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
| 4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
| 55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
| Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
| Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
| Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
| 8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
| 10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
| Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
| Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
| Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
| Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
| 5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
| Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
| 205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
| 16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
| Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
| 6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
| Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
| Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
| 47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
| Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
References
- Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
- Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker’s yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
- ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
- Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
- Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
- Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).
- Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. 유전학. 116, 349-358 (1987).
- Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
- Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture – making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
- Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
- Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. , (2012).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
- Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
- Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4 (2007).
- Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
- Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).
