Мы описываем адаптации оптической томографии проекции (OPT)<sup> 1</sup>, Чтобы изображение в ближней инфракрасной области спектра, а также осуществление ряда вычислительных средств. Эти протоколы позволяют оценкам поджелудочной железы β-клеточной массы (BCM) в более крупные экземпляры, увеличить мощность многоканального техники и повышение качества OPT данных.
По адаптации OPT, чтобы включить возможность обработки изображений в ближней инфракрасной (ИК) спектра, то здесь, иллюстрируют возможность изображение более крупные тела ткани поджелудочной железы, такие, как крысы поджелудочной железы, а также увеличить количество каналов (типы клеток), которые могут быть изучены в единственном экземпляре. Мы также описывают реализацию ряда вычислительных средств, которые обеспечивают: 1 / точное позиционирование (в нашем случае поджелудочная железа) образца центра масс (COM) на оси вращения (AR) 2, 2 / улучшенные алгоритмы сообщение выравнивание настройка, которая предотвращает геометрических искажений во время томографической реконструкции 2 и 3 / протокол для выравнивания интенсивности увеличить сигнал шум в OPT-BCM на основе определения 3. Кроме того, мы описываем держатель образца, что сводит к минимуму риск непреднамеренного перемещения образца в процессе получения изображения. Вместе взятые, эти протоколы позволяют оценкам BCM распределения и др.э возможности, должны быть выполнены во всем объеме нетронутыми pancreata или других органов (например, в исследованиях трансплантации островков), с разрешением вплоть до уровня отдельных островков Лангерганса.
Продуцирующих инсулин β-клетки играют ключевую роль в способности организма контролировать гомеостаз глюкозы в крови. Таким образом, оценка распределения BCM поджелудочной железы крайне важны для многих областей доклинических исследований диабета. В оценке терапевтических режимов, например, влияние целевых генов абляции на эндокринную дифференцировки клеток или исследования диабета этиологии у грызунов моделей для болезни часто зависит от таких анализов. Традиционно, эти виды оценок полагались на времени стереологического подходы, которые трудно выполнить из-за размера и сложного анатомического строения поджелудочной железы. Самое высокое разрешение изображений подходов в настоящее время (обычно оптический), не обеспечивают достаточную глубину проникновения, чтобы все визуализации поджелудочной железы грызунов. И наоборот, изображения подходы, которые не ограничены их глубина проникновения (как правило, ядерные) предоставляют низкое разрешение разрешить полное распределение BCM и мешаетв связи с отсутствием адекватных контрастных агентов 4,5.
Оптическая томография проекции 3D метода визуализации, который позволяет с высокой разрешающей оценки медико-биологических образцов на мм до см шкале 6. Настоящим информации о пространственном положении и объем отдельных инсулина выражения островков Лангерганса могут быть извлечены по всему объему поджелудочной железы в нормальных и диабетических мышей 3,7-10. Цель данного исследования заключается в дальнейшем укреплении потенциала этой техники для оценки поджелудочной железы β-клеток, их эндогенным распределения, когда привитые в других тканях, их связь с другими составляющими поджелудочной железы (например, проникновение типы клеток) и в большей препараты поджелудочной железы, чем это было возможно ранее.
Ближней инфракрасной оптической томографии проекции (NIR-OPT) установки
В приведенном ниже протоколы, OPT сканер на основе оригинальной настройке описывается Шарпу <eм> и др. 1, адаптированные к визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне описаны и использованы. Для оценки одного канала поджелудочной железы мыши (например, BCM), SkyScan 3001 (Bioptonics) сканер может быть использован.
Металлогалогенные лампы, что обеспечивает более высокую энергию возбуждения, чем дуговой ртутной лампы на длинах волн выше 650 нм, поставляет возбуждающего света. Свет передается через жидкие световод. Полезные сочетания флуорохромы и полосового фильтра для NIR флуоресценции и разделение каналов показано на рисунке 3. Излучаемого света обнаружен с задней подсветкой ПЗС-камеры, с высокой квантовой эффективностью в спектре НДК. OPT сканирования автоматизированы с помощью платформы LabView, который управляет камерой и шагового двигателя. Для поддержки образцы в размере нетронутыми pancreata крысы, защищенный покрытием из серебра зеркало и большой кювет используется. Наконец, держатель образца, который устраняет нежелательные вертикальные movemenTS образца во время сканирования была разработана.
Описанные методы OPT изображений позволяет добыче пространственных и количественных параметров по всему объему мышиной поджелудочной железы. Из-за ограничений в достижимое разрешение для этого типа мезоскопических изображений следует отметить, что, как и для большинства методов визуализации, тем больше образцов, тем ниже разрешение (Хотя использование более высокого разрешения CCD должны увеличивать разрешение сканирования OPT) . Таким образом, для оценки доли нетронутыми мыши поджелудочной железы, техника в настоящее время не обеспечивает единую резолюцию клетки, хотя близко (приблизительно 15-20 мкм) 7. Тем не менее, для извлечения BCM распределения в поджелудочной железе мыши протоколы были получены данные, что более чем хорошо совпадают получены, например, подсчет числа точек морфометрии 3,13 Следует отметить, что, хотя реализация протокола CLAHE позволяет для обнаружения значительно больше островков , эти островки, как правило, меньше и не вкладаТе существенный вклад в общий β-клетки томах.
Иммуногистохимического протоколов участвует сравнительно длительные (до двух недель), но фактическое рук на время подготовки образца короткая и поэтому этот метод хорошо подходит для изучения больших когорт животных 9. Если потенциал гетерогенные модели распределения внимания для исследования, следует подчеркнуть, что следует проявлять осторожность в отношении шагов фиксации и монтажа, чтобы избежать этого ткани поджелудочной железы становится зафиксирован в неблагоприятных пути и плоские («расползаются» ) крепления ткани следует стремиться содействовать таких оценок.
Важным вопросом при проведении ОПТ является то, что COM образца устанавливается на оси вращения, и что он не двигается, либо вертикально, либо горизонтально, во время процедуры сканирования. Поэтому очень важно иметь стабильные механические установки и хорошо функционирующая система attachiнг образца. Мы решили эту проблему путем строительства нового крепления (рис. 7).
Параллельно геометрия была не относится к нашему NIR-OPT или Bioptonics 3001 сканер, который был обнаружен в виде вертикального сдвига между задней и передней позиции периферических объектов в проекции изображений, записанных. Регулируя объект источника расстоянии в лог-файл соответствующего сканера (см. 2.3.1) мы могли бы значительно улучшить качество наших данных и коррекции геометрических искажений на дальнем краю проекции изображения, что особенно важно при оценки более крупные экземпляры.
В текущем протоколе, мы предоставляем предложение наборы фильтров, которые позволяют визуализации трех различных конкретных каналов и «анатомии» канала в оценках нетронутыми препараты поджелудочной железы. Очевидно, что эти параметры могут быть модулированной, чтобы лучше соответствовать флуорохромы использованы для данного исследования, хотя, как и во всех формах флуоресценциипроцентов микроскопии, потенциальной опасности сигнал проступание должны быть тщательно проанализированы. Исследование инсулина помечены островки флуорохромами, которые возбуждаются выше 750 нм до сих пор не удалось нами по металлогалогенные лампы, что наши настройки используются. Вполне возможно, что камеры с еще более высокой квантовой эффективностью в соответствующих длин волн в сочетании с альтернативными источниками света (например, диодные лазеры) может увеличить потенциал NIR-OPT дальше и позволить для работы с изображениями при еще более высоких волнах.
OPT изображений является весьма универсальный метод для пространственные и количественные оценки биомедицинских образца на мм-см масштабе. Хотя протоколы, представленные здесь, были разработаны для основных целей поджелудочной железы / диабете исследований они должны быть возможно перевести на исследования других видов, типов и образцов маркеров. По потенциал, чтобы визуализировать несколько отдельных каналов в неповрежденном препараты поджелудочной железы, NIR-OPT изображений Further имеет потенциал в качестве инструмента для оценки поглощения специфика контрастных агентов предназначен для неинвазивной оценки других методов визуализации тех пор, пока эти контрастные вещества могут быть предназначены для перевозки и флуорофор обнаруживается ОПТ.
The authors have nothing to disclose.
Д-р П. Линдстрем признано за предоставление OB / OB мышей. J. Лехтонен признан за помощь в производстве видео и J. Gilbert за помощь в редактировании. Это исследование было поддержано грантами от диабета научно-исследовательского института Foundation (AP), детского диабета исследовательский фонд (AP и UA), Европейская комиссия (FP-7, Грант соглашения нет. CP-IP 228933-2) (JS и UA), Кемпе фонды, Умео университета и Шведского исследовательского совета в UA
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
Liquid Light Guide | 11504116 | ||
Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |