קרוב אינפרא האדומה האופטית טומוגרפיה תחזית להערכות של חלוקת מסת β-תאים בחקר הסוכרת
Summary
אנו מתארים את ההסתגלות של טומוגרפיה הקרנה האופטית (OPT)<sup> 1</sup> להדמיה בספקטרום הקרוב אינפרא האדום, והיישום של מספר הכלים חישוביים. פרוטוקולים אלה מאפשרים הערכות של מסת β-תאי לבלב (BCM) בדגימות גדולות יותר, להגדיל את הקיבולת רב של הטכניקה ולשפר את איכות נתוני שטחים כבושים.
Abstract
על ידי התאמה כבושה לכלול יכולת ההדמיה בספקטרום האינפרא האדום הקרוב (NIR), אנחנו כאן ממחישים את האפשרות לגופי תמונות גדולים יותר של רקמת לבלב, כגון לבלב החולדה, ולהגדיל שעשויה מספר הערוצים (סוגי תאים) להיחקר בדוגמה אחת. אנחנו עוד יותר לתאר את היישום של מספר הכלים חישוביים המספקים: מיצוב 1 / מדויק של דגימה (במקרה שלנו בלבלב) מרכז המסה (COM) בציר הסיבוב (ע"ר) 2; 2 אלגוריתמים / משופרים להודעה יישור כוונון המונע עיוותים גיאומטריות במהלך טומוגרפית השיקום 2 ו 3 / פרוטוקול להשוואת עוצמת להגדיל אות לרעש ביחסי קביעות BCM הכבושים מבוססות 3. בנוסף, אנו מתארים בעל מדגם שממזער את הסיכון לתנועות מכוונות של הדגימה בתמונת רכישה. יחד, פרוטוקולים אלה מאפשרים הערכות של הפצה וoth BCMתכונות אה, שיש לבצע בכל היקף pancreata השלם או איברים אחרים (למשל, במחקרים של איון השתלה) עם רזולוציה עד לרמה של איים בודדים לנגרהנס.
Introduction
מייצר האינסולין β-תאים הם מפתח ליכולת של הגוף לשלוט הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. לכן, הערכות של הפצת BCM לבלב הן הכרחיות לתחומים רבים של מחקר סוכרת טרום קליני. בהערכות של משטרים טיפוליים לדוגמה, ההשפעה של אבלציה גן הממוקד בבידול האנדוקרינית תא או מחקרים של אטיולוגיה סוכרת במכרסמים למחלה לעתים קרובות תלויה בניתוחים מסוג זה. באופן מסורתי, אלו סוגים של ערכות הסתמכו על גישות לצרוך זמן stereological שקשה לבצע בשל הגודל והחוקה האנטומי מורכבת של הלבלב. גישות הדמיה ברזולוציה גבוהה ביותר כיום (בדרך כלל אופטי), אינם מספקות עומק חדירה מספיק כדי לאפשר הדמית לבלב כולו במכרסמים. לעומת זאת, גישות הדמיה, שאינם מוגבלות על ידי עומק החדירה שלהם (בדרך כלל גרעיני) לספק לרזולוציה נמוכה כדי לפתור את הפצת BCM המלאה והם הקשובשל המחסור בסוכנים בניגוד הולם 4,5.
טומוגרפיה הקרנה האופטית היא שיטת הדמית 3D, המאפשרת הערכות ברזולוציה הגבוהה של הדגימות ביו במ"מ לקנה מידת הסנטימטר 6. בזאת, מידע על המיקום והנפח של אינסולין האדם להביע איים לנגרהנס המרחבית עשוי להיות מופק בכל הנפח של הלבלב בעכברים נורמלים וסוכרתיים 3,7-10. מטרת המחקר הנוכחי היא לשפר את היכולת של טכניקה זו להערכת לבלב β-תאים נוספים; הפצת אנדוגני, כאשר הושתלו לתוך רקמות אחרות, הקשר שלהם לבוחרי לבלב אחרים (כגון החדרת סוגי תאים) וגדול יותר הכנות לבלב יותר אפשרי בעבר.
טומוגרפיה קרובת אינפרא האדומה אופטי ההקרנה (ניר-OPT) ההתקנה
בהמשך הפרוטוקולים, סורק כבוש מבוסס על הסדרה המקורית תוארה על ידי שארפ <eמ> 1 et al, מותאם להדמיה בטווח הקרוב אינפרא האדום מתואר ומשומש. להערכות ערוץ אחד של לבלב העכבר (למשל של BCM), SkyScan 3001 סורק (Bioptonics) עשוי לשמש.
מנורה הליד מתכת המספקת אנרגית עירור גבוהה יותר מאשר מנורת קשת כספית באורכי גל מעל 650nm, מספקת אור העירור. האור מועבר באמצעות אור מדריך נוזלי. שילוב שימושי של fluorochromes ומסננים מעבירים פס לניר דימות פלואורסצנטי והפרדת ערוץ מוצג באיור 3. האור הנפלט מזוהה עם מצלמת CCD מואר מאחור, עם יעילות הקוונטית גבוהה בספקטרום הניר. סריקת השטחים הכבושים היא אוטומטית באמצעות פלטפורמת LabVIEW ששולטת במצלמה ומנוע צעד. כדי לתמוך בדגימות בגודל של pancreata השלם חולדה, מראה מצופה כסף מוגן וקובט גדול משמש. לבסוף, בעל מדגם שמבטל movemen האנכי לא רצויts של המדגם במהלך הסריקה תוכנן.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקות המתוארות לשטחי הדמיה מאפשרות מיצוי של פרמטרים מרחביים וכמותיים לאורך היקף הלבלב העכברי. בשל מגבלות ברזולוצית השגה עבור סוג זה של mesoscopic הדמיה יש לציין, כי כעבור רוב שיטות הדמיה, הדגימה גדולה יותר נמוכה הרזולוציה (למרות השימוש גבוה CCD ברזולוציה צריך להגדיל את הרזולוציה של שטחי הסריקה) . לפיכך, להערכת אונות עכבר לבלב תקינות, בטכניקה נוכחית אינה מספקת רזולוצית תא בודדה למרות שקרובים (15-20 מיקרומטר בקירוב) 7. ובכל זאת, להפקת הפצת BCM בלבלב עכבר הפרוטוקולים ספקו נתונים שיותר תתאימו גם לאלה שהושגו על ידי נקודה למשל ספירה morphometry 3,13 יש לציין כי למרות שיישומו של פרוטוקול CLAHE מאפשר זיהוי של איים באופן משמעותי יותר , האיים אלה הם בדרך כלל קטנים ולא contribuטה באופן מהותי להיקפים הכוללים β-התאים.
פרוטוקולי immunohistochemical המעורבים הם ארוכים יחסית (עד שבועות), אבל הידות בפועל בזמן להכנת דגימה הן קצרות ולכן הטכניקה מתאימה גם למחקר של קבוצות גדולות של בעלי חיים 9. אם הפוטנציאל של דפוסי תפוצה הטרוגנית הוא מוקד לחקירה, יש להדגיש שיש להיזהר בצעדים בנוגע לקיבוע ואת ההרכבה, כדי למנוע שרקמת הלבלב הופכת קבוע בדרך שלילית ושטוח ("פרוש" ) הר של הרקמה יש חתר לכדי להקל על הערכות אלה.
נושא חשוב בעת ביצוע כבוש הוא שCOM של המדגם קבוע על ציר סיבוב ושזה לא זז, או אנכי או אופקי, במהלך הליך הסריקה. לכן זה חיוני כדי להיות יציב התקנה מכאנית ומערכת מתפקדת היטב לattaching המדגם. אנחנו פתרנו את הבעיה על ידי בניית הר חדש (איור 7).
גיאומטריה מקבילה לא הייתה נכונה לניר שטחינו או סורק Bioptonics 3001, שזוהה כמשמרת אנכית בין החלק האחורי והקדמיות של אובייקטי העמדות היקפיים בהקרנת התמונות המוקלטות. על ידי התאמה למרחק אובייקט מקור בקובץ היומן של הסורק המתאים (ראה 2.3.1) אנו יכולים לשפר באופן משמעותי את איכות הנתונים שלנו ולתקן את העיוותים גיאומטריות לקצוות המרוחקים של הקרנת תמונות, וזה חשוב במיוחד כאשר הערכת דגימות גדולות.
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מספקים הצעה קובעת מסנן המאפשרים הדמיה של שלושה ערוצים ספציפיים שונים וערוץ "האנטומיה" בהערכות של הכנות לבלב שלמות. ברור שהגדרות אלה יכולים להיות מווסתות טובים יותר כדי להתאים את fluorochromes מנוצל למחקר נתון למרות, כמו עם כל הצורה של מנורות ניאוןמיקרוסקופיה אחוזים, הסיכון הפוטנציאלי של אות לדמם דרך יש להעריך בזהירות. המחקר של איוני אינסולין שכותרתו עם fluorochromes שמתלהבים מעל 750 ננומטר עדיין לא היה אפשרי על ידינו באמצעות מנורה הליד המתכת שהקבוצה שלנו עד מנצלת. ייתכן שמצלמה עם יעילות הקוונטית גבוהה אף יותר באורכי הגל הרלוונטיים בשילוב עם מקורות אור חלופיים (למשל לייזרי דיודה) יכולה להגביר את הפוטנציאל של ניר-כבוש נוספת ולאפשר הדמיה באורכי גל גבוהים יותר.
שטחי הדמיה היא טכניקה מאוד תכליתית עבור הערכות מרחביים וכמותית של דגימה ביו בסולם מ"מ-הסנטימטר. למרות שהפרוטוקולים שהוצגו כאן פותחו למטרה העיקרית של מחקר לבלב / סוכרת הם צריכים להיות אפשריים לתרגם למחקר על מינים אחרים, סוגי דגימה וטושים. על ידי הפוטנציאל לדמיין כמה ערוצים נפרדים בהכנות לבלב שלמות, ניר-כבוש הדמיה וurther בעל הפוטנציאל ככלי להעריך את הספציפיות הספיגה של חומר ניגוד המיועד להערכות בלתי פולשניות בשיטות הדמיה אחרות, כל עוד סוכנים בניגוד אלה יכולים להיות מתוכננים לבצע זיהוי על ידי fluorophore כבוש גם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ינדסטרום ד"ר פ 'הוא הודה למתן עכברי ob / ob. ג'יי הטונן הוא הודה על סיוע בהפקת וידאו וג' גילברט לעזרה בעריכה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון לחקר סוכרת הקרן (AP), סוכרת נעורי Research Foundation (AP וUA), הנציבות האירופיות (FP-7, הסכם גרנט לא:. CP-IP 228933-2) (JS ו UA), יסודות קמפ, Umeå האוניברסיטה ומועצת המחקר השבדית לUA
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
References
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753 (2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
