Vi beskriver isolering af humane atriale myocytter som kan anvendes til intracellulær Ca<sup> 2 +</sup> Målinger i kombination med elektrofysiologiske patch-clamp-forsøg.
Studiet af elektrofysiologiske egenskaber af hjerte ionkanaler med patch-clamp teknik og udforskning af cardiac cellulær Ca2 + håndtering abnormiteter kræver isolerede cardiomyocytes. Desuden er muligheden for at undersøge myocytter fra patienter, som anvender disse teknikker en uvurderlig krav at belyse den molekylære basis for hjertesygdomme, såsom atrieflimren (AF). 1. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af humane atriale myocytter som er egnet til både patch-clamp-forsøg og samtidige målinger af intracellulære Ca 2 + koncentrationer. Først højre atrium vedhæng opnået fra patienter, der gennemgår åben hjertekirurgi hakket i små væv bidder ("bid-metoden"), og vaskes i Ca 2 +-fri løsning. Så væv klumper er fordøjet i collagenase og protease opløsninger med 20 pM Ca 2 +. Derefter de isolerede myocytes er harveplace ved filtrering og centrifugering af vævssuspensionen. Endelig er Ca2 +-koncentration i cellen lagerløsning justeret trinvist til 0,2 mM. Vi kort diskutere betydningen af Ca 2 + og Ca 2 + buffering under isolation processen og også give repræsentative optagelser af aktionspotentialer og membran strømninger, både sammen med samtidige Ca 2 + forbigående målinger udført i disse isolerede myocytes.
Studere elektrofysiologiske egenskaber af hjerte ionkanaler med patch-clamp teknik og udforskning af cellulære Ca 2 + håndtering abnormiteter kræver isolerede cardiomyocytes. Disse er normalt opnået efter in vitro eksponering af hjerte vævsprøver til fordøjelsesenzymer (collagenase, hyaluronidase, peptidase osv.). Siden den første rapport af isolering af levedygtige hjertemyocytter i 1955 2 en stor mængde af protokoller er blevet udviklet med henblik på at høste enkelt atrielle og ventrikulære cardiomyocytter fra forskellige arter, herunder mus, rotte, kanin, hund, marsvin og menneske. I denne gennemgang fokuserer vi på isolering af humane atrielle myocytes. Vedrørende procedurer for isolering af myocytter fra andre arter, vi refererer til "Worthington Tissue Dissociation guide" fra Worthington Biochemical Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).
<p class= "Jove_content"> Menneskelige atrielle myocyte isolation protokoller er generelt afledt af fremgangsmåden beskrevet af Bustamante, et al. 3. Her giver vi et trin-for-trin beskrivelse af en teknik, der er tilpasset fra en tidligere publiceret metode, med henblik på at opnå atrielle myocytes egnede ikke kun for patch-clamp eksperimenter, men også for samtidige intracellulære Ca2 + målinger. 4-11Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af humane atriale myocytter fra højre atrium vedhæng opnået fra patienter, der gennemgår åben hjertekirurgi. For at bruge disse myocytter til måling af cytosolisk Ca2 + vi tilpasset en tidligere beskrevet metode 4-11 ved at udelade EGTA fra storageløsning.
Allerede i 1970 blev det observeret, at selv om myocytter dissocierer i nærværelse af Ca2 + under fordøjelsen, alle af dem var i kontraktur og ikke-levedygtige. 16,17 Derfor celleisolering udføres i Ca2 +-fri opløsning. Imidlertid genindførelsen af fysiologiske koncentrationer af Ca2 + resulterede i hurtig Ca2 +-indstrømning og celledød. Dette er blevet beskrevet som Ca2 + paradoks fænomen, som oprindeligt blev observeret i perfunderede hjerter ved Zimmerman og Hulsman. 18. Ændringer af isoleringsmedier herunder reduktion af pH til 7,0, <sup> 19 tilsætning af taurin 20 eller af små mængder Ca2 + (se trin 3.2 og 4.1), 21 samt opbevaring af isolerede myocytter i EGTA indeholdende storage-løsning 22 er blevet foreslået for at forhindre Ca2 + paradoks. 17. Men det er velkendt, at Ca2 + buffering gennem EGTA reducerer amplituden af L-typen Ca 2 + strøm-induceret Ca2 + forbigående amplituder og resulterer i en bifasisk henfald af Ca 2 + transienter. 23. Derfor har vi udeladt EGTA hele isolation processen for at opnå Ca 2 +-transienter med typiske egenskaber og monofasiske henfald. At beskytte cellerne fra Ca 2 + paradoks vi øget endelige Ca2 +-koncentration af lageret opløsning i en trinvis måde, indtil 0,2 mM.
Valget af collagenase er sandsynligvis det mest kritiske skridt for en vellykket myocyt isolation. Konventionel collagenases er råpræparater opnået fra Clostridium histolyticum og indeholder collagenase foruden en række andre proteinaser, polysaccharidases og lipaser. Baseret på deres generelle sammensætning kollagenaser er opdelt i forskellige typer. 24. Worthington kollagenase type I og II, er blevet anvendt med succes til isolering af humane atriale myocytes. 4-10,15,25-30 I vores nuværende beskrevne protokol anbefaler vi brug af collagenase Type I, selv om vi var også i stand til at opnå acceptable mængder af levedygtige celler ved hjælp af kollagenase type II. Men selv inden for en enkelt kollagenase type er der en betydelig batch-til-batch variation vedrørende enzymaktiviteterne. Disse variationer kræver omhyggelig batch udvælgelse og afprøvning af forskellige partier til at optimere isolation procedure. Den tilgængelige online batch-udvælgelse værktøj fra Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) kan anvendes til at finde ledige partier med en sammensætning, der har vist sig at være egnet til isolering af humane atriale myocytter. I øjeblikket bruger vi collagenase type I med 250 U / mg collagenase aktivitet 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg clostripain aktivitet og 0,48 U / mg tryptisk aktivitet (parti # 49H11338).
De celler opnået ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i dette manuskript kan anvendes inden 8 timer til patch-clamp-forsøg, Ca 2 + forbigående målinger og en kombination af begge. 15. Desuden disse celler tillader målinger af cellulære sammentrækning som reaktion på elektrisk felt stimulation eller elektrisk stimulation ved hjælp af patch-clamp pipette (upublicerede observationer).
The authors have nothing to disclose.
Desuden takker vi hjertets kirurger på Heidelberg Universitet for levering af humane atrievæv og Claudia Liebetrau, Katrin Kupser og Ramona Nagel for deres fremragende tekniske support. Særlige tak også til Andy W. Trafford for hans nyttige forslag og råd under etableringen af Ca 2 + forbigående målinger. Forfatterne ønsker at udtrykke deres dybeste taknemmelighed til medlemmerne af Institut for Farmakologi og Toksikologi (hoved: Ursula Ravens) i Dresden Teknologiske Universitet for muligheden tilbudt de os til at lære de grundlæggende teknikker og færdigheder i cellulær elektrofysiologi og cardiomyocyte isolation.
Forfatternes forskning er støttet af den tyske Research Foundation (Do769/1-1-3), det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning gennem atrieflimren Competence Network (01Gi0204) og den tyske Center for Cardiovascular Research, EU gennem Europæiske Netværk for Translationel forskning i atrieflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, store integrerede projekt, forslag nr. 261.057) og den europæiske-nordamerikanske atrieflimren Research Alliance (ENAFRA) tilskud på Fondation Leducq (07CVD03).
Den skematiske oversigt er vist i videoen filen blev fremstillet ved hjælp af Servier medicinsk art.
Transport solution | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
Table I. Solutions. | |||
Company | Catalogue number | ||
Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
Table II. Specific equipment. | |||
Company | Catalogue number | ||
Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
Company | Catalogue number | Bath solution | |
4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
pH | Bath solution: 7.35 | ||
adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
Company | Catalogue number | Pipette solution | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
pH | 7.20 | ||
adjusted with | 1 M KOH | ||
Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||