Vi beskriver isoleringen av humana atriella myocyter som kan användas för intracellulär Ca<sup> 2 +</sup> Mätningar i kombination med elektrofysiologiska patch-clamp studier.
Studiet av elektrofysiologiska egenskaper hos jonkanaler med patch-clamp teknik och utforskandet av hjärt-cellulär Ca2 + hanterar avvikelser kräver isolerade hjärtmuskelceller. Dessutom är möjligheten att undersöka myocyter från patienter som använder dessa tekniker ett ovärderligt kravet att belysa den molekylära grunden för hjärtsjukdomar, såsom förmaksflimmer (AF). 1 Här beskriver vi en metod för isolering av humana atriella myocyter som är lämpliga för både patch-clamp-studier och samtidiga mätningar av intracellulära Ca2 +-koncentrationer. Först höger förmak bihang erhållna från patienter som genomgår öppen hjärtkirurgi hackad i små vävnad bitar ("bit metoden") och tvättas i Ca2 +-fri lösning. Då vävnaden bitar smälts i koUagenas och proteas innehållande lösningar med 20 pM Ca 2 +. Därefter de isolerade myocyter harvested genom filtrering och centrifugering av vävnaden suspensionen. Slutligen är den Ca2 +-koncentrationen i cellen lagringslösning justeras stegvis till 0,2 mM. Vi diskuterar kortfattat innebörden av Ca 2 + och Ca 2 + buffring under isoleringen processen och även ge representativa inspelningar av aktionspotentialer och strömmar membran, både tillsammans med samtidig Ca2 + transienta mätningar som utförs i dessa isolerade muskelceller.
Studera elektrofysiologiska egenskaper hos jonkanaler med patch-clamp teknik och utforskandet av cellulär Ca2 + hantering avvikelser kräver isolerade hjärtmuskelceller. Dessa är oftast erhålls efter in vitro exponering av hjärt vävnadsprover till matsmältningsenzymer (kollagenas, hyaluronidas, peptidas etc.). Sedan den första rapporten av isolering av livskraftiga hjärtmyocyter 1955 2 en stor mängd protokoll har utvecklats för att skörda enstaka förmaks-och ventrikulär cardiomyocytes från olika arter, inklusive mus, råtta, kanin, hund, marsvin och människa. I denna översyn kommer vi att fokusera på isolering av humana atriella myocyter. Beträffande förfaranden för isolering av myocyter från andra arter som vi hänvisar till "Worthington vävnadsdissociering guide" från Worthington Biochemical Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).
<p class= "Jove_content"> är mänskliga förmaks myocyte isolering protokoll allmänhet härrör från den metod som beskrivs av Bustamante, et al. 3 Här ger vi en steg-för-steg beskrivning av en teknik som är anpassad från en tidigare publicerad metod, i syfte att erhålla atriella myocyter lämpliga inte bara för patch-clamp-experiment utan även för samtidiga intracellulära Ca2 +-mätningar. 4-11Här beskriver vi en metod för isolering av humana atriella myocyter från höger atriumbihangen erhållna från patienter som genomgår öppen hjärtkirurgi. För att kunna använda dessa myocytes för mätningar av cytosoliskt Ca 2 + vi anpassat en tidigare beskriven metod 4-11 genom att utelämna EGTA från lagringslösning.
Redan 1970 konstaterades att även myocytes dissocierar i närvaro av Ca2 + under matsmältningen, var alla av dem i kontraktur och icke livskraftiga. 16,17 Därför cellisolering utförs i Ca2 +-fri lösning. Emellertid återinförandet av fysiologiska koncentrationer av Ca 2 + resulterade i en snabb Ca 2 ^-inflöde och celldöd. Detta har beskrivits som den Ca2 + paradox fenomen som ursprungligen sågs i perfunderade hjärtan av Zimmerman och Hulsman. 18 Ändringar av isoleringsmedia däribland sänkning av pH till 7,0, <sup> 19 tillsats av taurin 20 eller av små mängder av Ca2 + (se steg 3.2 och 4.1), 21 samt lagring av isolerade myocyter i EGTA innehållande förvaring-lösning 22 har föreslagits för att förhindra Ca2 + paradox. 17 Det är emellertid väl känt att Ca 2 + buffring genom EGTA minskar amplituden av L-typ Ca 2 + ström-inducerad Ca 2 + transienta amplituder och resulterar i en bifasisk sönderfallet av Ca 2 +-transienter. 23 Därför utelämnade vi EGTA genom hela isoleringsprocessen för att erhålla Ca 2 +-transienter med typiska egenskaper och monofasiska sönderfall. För att skydda cellerna från Ca2 + paradox vi ökat den sista Ca 2 + koncentrationen av lagringslösning på ett stegvis sätt tills 0,2 mM.
Valet av kollagenas är förmodligen det mest kritiska steget för framgångsrik myocyte isolering. Konventionell collagenases är råa beredningar som utvinns ur Clostridium histolyticum och innehåller kollagenas förutom ett antal andra proteinaser, polysaccharidases och lipaser. Baserat på deras allmänna sammansättningen koUagenaser är uppdelade i olika typer. 24 Worthington kollagenas typ I och II med framgång har använts för isolering av humana atriella myocyter. 4-10,15,25-30 I vår nu beskrivna protokoll vi rekommenderar användning av kollagenas Typ I, även om vi också kunna få acceptabla mängder av livsdugliga celler med kollagenas typ II. Men även inom en och samma kollagenas typ finns det en betydande sats-till-sats variation beträffande enzymaktiviteterna. Dessa variationer kräver noggrann batch urval och testning av olika partier för att optimera isolering förfarande. Online tillgängliga batch-markeringsverktyg från Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) kan användas för att hitta lediga satser med en komposition som har visat sig vara lämpliga för isolering av humana atriella myocyter. För närvarande använder vi kollagenas typ I med 250 U / mg kollagenasaktivitet, 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg klostripain aktivitet och 0,48 U / mg tryptisk aktivitet (mycket # 49H11338).
De celler som erhållits med användning av förfarandet som beskrivs i detta manuskript kan användas inom 8 h för patch-clamp-studier, Ca 2 + transienta mätningar och en kombination av båda. 15 Dessutom är dessa celler kunna mäta cellulärt sammandragning som svar på elektrisk fältstimulering eller elektrisk stimulering med användning av patch-clamp pipett (opublicerade observationer).
The authors have nothing to disclose.
Dessutom tackar vi de hjärt kirurger vid Heidelbergs universitet för tillhandahållande av mänskliga förmaksflimmer vävnad och Claudia Liebetrau, Katrin Kupser och Ramona Nagel för deras utmärkta tekniska support. Särskilt tack också till Andy W. Trafford för hans användbara förslag och råd under upprättandet av Ca2 + transienta mätningar. Författarna vill uttrycka sin djupaste tacksamhet till medlemmarna i avdelningen för farmakologi och toxikologi (head: Ursula Ravens) av Dresdens Tekniska Universitet för tillfället de erbjöd oss att lära sig grundläggande tekniker och färdigheter i cellulär elektrofysiologi och cardiomyocyte isolering.
Författarnas forskning stöds av den tyska Research Foundation (Do769/1-1-3), det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning genom Förmaksflimmer Competence Network (01Gi0204) och den tyska Centrum för kardiovaskulär forskning, Europeiska unionen genom Europeiska nätverket för translationell forskning i förmaksflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, och stora integrerade projekt, förslag nr 261.057) och Europeiska-nordamerikanska förmaksflimmer Research Alliance (ENAFRA) beviljande av Fondation Leducq (07CVD03).
Den schematiska översikten visas i videofilen producerades med Servier medicinsk art.
Transport solution | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
Table I. Solutions. | |||
Company | Catalogue number | ||
Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
Table II. Specific equipment. | |||
Company | Catalogue number | ||
Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
Company | Catalogue number | Bath solution | |
4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
pH | Bath solution: 7.35 | ||
adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
Company | Catalogue number | Pipette solution | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
pH | 7.20 | ||
adjusted with | 1 M KOH | ||
Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||