Vi beskriver isolering av humane atrielle myocytter som kan brukes for intracellulær Ca<sup> 2 +</sup> Målinger i kombinasjon med elektrofysiologiske patch-klemme studier.
Studiet av elektrofysiologiske egenskaper av kardiale ionekanaler med patch-clamp teknikken og utforskningen av hjerte mobilnettet Ca 2 + håndterer avvik krever isolerte cardiomyocytes. I tillegg er det mulig å undersøke myocytter fra pasienter ved hjelp av disse teknikker en uvurderlig kravet til å belyse den molekylære basis av kardiale sykdommer som atrial fibrillering (AF). Ett Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering av humane atrielle myocytter som er egnet for både patch-clamp studier og samtidige målinger av intracellulær Ca 2 + konsentrasjoner. Først er riktige auriklene innhentet fra pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi hakket i små vev biter ("blings metoden") og vasket i Ca 2 +-free løsning. Deretter vevet biter blir fordøyd i collagenase og protease inneholder løsninger med 20 mikrometer Ca 2 +. Deretter, de isolerte myocytes er harveSTED ved filtrering og sentrifugering av vev-suspensjon. Endelig er Ca 2 +-konsentrasjonen i cellen lagringsløsning justeres trinnvis til 0,2 mM. Vi kort diskutere betydningen av Ca 2 + og Ca 2 + bufring under isolasjon prosessen og også gi representative innspillinger av aksjonspotensialer og membran strømmer, både sammen med samtidig Ca 2 + forbigående målinger, utført i disse isolerte myocytes.
Studerer elektrofysiologiske egenskapene til kardiale ionekanaler med patch-clamp teknikken og utforskningen av mobilnettet Ca 2 + håndtering unormalt krever isolerte cardiomyocytes. Disse er vanligvis oppnådd ved å følge den in vitro-eksponering av kardiale vevsprøver til fordøyelsesenzymer (kollagenase, hyaluronidase, peptidase etc.). Siden den første rapport av isolering av levedyktige hjertemuskelceller i 1955 2 en stor mengde protokoller er utviklet for å høste enkelt-atriale og ventrikulære kardiomyocytter fra forskjellige arter, inkludert mus, rotte, kanin, hund, marsvin og menneske. I denne gjennomgangen har vi fokus på isolering av humane atrie myocytes. Angående prosedyrer for isolering av myocytes fra andre arter vi refererer til "Worthington Tissue Dissosiasjon guide" levert av Worthington Biokjemisk Corp, USA ( www.tissuedissociation.com ).
<p class= "Jove_content"> Menneskelige atriale myocyte isolasjon protokoller er generelt avledet fra metoden beskrevet av Bustamante, et al. 3. Her har vi gi en trinn-for-trinn beskrivelse av en teknikk som er tilpasset fra en tidligere publisert metode, for å kunne skaffe atrielle myocytter egnet ikke bare for patch-clamp eksperimenter, men også for samtidig intracellulære Ca 2 + målinger. 4-11Her beskriver vi en metode for isolering av humane atriefrekvenser myocytes fra høyre auriklene innhentet fra pasienter som gjennomgår åpen hjertekirurgi. For å kunne bruke disse myocytes for målinger av cytosolisk Ca 2 + vi tilpasset en tidligere beskrevet metode 4-11 ved å utelate EGTA fra lagringsløsning.
Allerede i 1970 ble det observert at selv om myocytes dissosierer i nærvær av Ca 2 + i løpet av fordøyelsen, alle var in kontraktur og ikke-levedyktige. 16,17 er derfor isolert celle utført i Ca2 +-fri løsning. Imidlertid re-innføring av fysiologiske konsentrasjoner av Ca2 + resulterte i hurtig Ca 2 + tilstrømning og celledød. Dette har blitt beskrevet som den Ca 2 + paradoksale fenomen som opprinnelig ble observert i perfused hjerter av Zimmerman og Hulsman. 18. Modifikasjoner av isoleringsventilen medier, inkludert reduksjon av pH til 7,0, <sup> 19 tilsetning av TAURIN 20 eller av små mengder av Ca 2 + (se trinn 3.2 og 4.1), 21 så vel som lagring av isolerte myocytter i EGTA inneholdende lagring-løsning 22 har vært foreslått for å hindre at Ca 2 + paradoks. 17. Imidlertid er det vel kjent at Ca 2 + bufring gjennom EGTA reduserer amplituden av L-type Ca2 + strøm-indusert Ca2 + transient amplituder og resulterer i en bifasisk nedbrytning av Ca 2 + transienter. 23. Derfor utelates vi EGTA gjennom hele prosessen isolasjon for å oppnå Ca 2 + transienter med typiske egenskaper og monofasisk henfall. For å beskytte cellene fra Ca 2 + paradoks vi økt den siste Ca 2 + konsentrasjon av lagringsløsning økes trinnvis inntil 0,2 mm.
Valget av collagenase er trolig den mest kritiske trinnet for vellykket myocyte isolasjon. Konvensjonell collagenases er råolje preparater hentet fra Clostridium histolyticum og inneholder kollagenase i tillegg til en rekke andre proteinaser, polysaccharidases og lipaser. Basert på deres generelle sammensetning collagenases er delt inn i ulike typer. 24. Worthington kollagenaseklassene type I og II har blitt brukt for isolering av humane atrie myocytes. 4-10,15,25-30 I vår dag beskrives protokollen vi anbefaler bruk av collagenase Type I, selv om vi var også i stand til å oppnå akseptable mengder av levedyktige celler ved hjelp av kollagenase type II. Men selv innenfor en eneste kollagenase typen er det en betydelig batch-til-batch variasjon angående enzymaktivitet. Disse variasjonene krever nøye batch valg og testing av ulike grupper for å optimalisere isolasjon prosedyre. Den elektroniske tilgjengelig batch-utvalget verktøyet fra Worthington Biokjemisk Corp ( http://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php) kan brukes for å finne ledige batcher med en sammensetning som har vist seg å være egnet for isolering av humane atrielle myocytter. Foreløpig bruker vi collagenase type I med 250 U / mg kollagenaseaktivitet, 345 U / mg caseinase aktivitet, 2,16 U / mg clostripain aktivitet og 0,48 U / mg tryptic aktivitet (vare # 49H11338).
Cellene oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i dette manuskriptet kan brukes innenfor 8 timers for patch-clamp studier, Ca 2 + transiente målinger og en kombinasjon av begge. 15. I tillegg er disse celler tillater målinger av cellulær sammentrekning som reaksjon på elektriske feltet stimulering eller elektrisk stimulering ved hjelp av patch-clamp pipette (upubliserte observasjoner).
The authors have nothing to disclose.
I tillegg vil vi takke de kardiale kirurger ved Universitetet i Heidelberg for levering av menneskelig atrial vev og Claudia Liebetrau, Katrin Kupser og Ramona Nagel for deres utmerkede teknisk støtte. Spesiell takk også til Andy W. Trafford for hans nyttige forslag og råd i etableringsfasen av Ca 2 + forbigående målinger. Forfatterne ønsker å uttrykke sin dypeste takknemlighet til medlemmer av Institutt for farmakologi og toksikologi (hode: Ursula Ravens) av Dresden teknologiske universitet for muligheten de tilbød oss å lære grunnleggende teknikker og ferdigheter i mobilnettet elektrofysiologi og cardiomyocyte isolasjon.
Forfatternes forskning er støttet av den tyske Research Foundation (Do769/1-1-3), den tyske føderale Utdannings-og forskningsdepartementet gjennom atrieflimmer Competence Network (01Gi0204) og den tyske Senter for Cardiovascular Research, EU gjennom Europa, Nettverk for translasjonsforskning i atrieflimmer (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, i stor skala integrere prosjektet Proposal No 261 057) og den europeisk-nordamerikanske atrieflimmer Forskning Alliance (ENAFRA) tilskudd av Fondation Leducq (07CVD03).
Skjematisk oversikt vist i videoen filen ble produsert ved hjelp av Servier medisinsk art.
Transport solution | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | Storage solution: 1% |
BDM | Sigma-Aldrich | 31550 | Transport solution: 30 |
DL-b-Hydroxy-butyric acid | Sigma-Aldrich | H6501 | Storage solution: 10 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Transport solution: 20 Ca2+-free solution: 20 Enzyme solution E1 and E2: 20 Storage solution: 10 |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | Storage solution: 70 |
KCl | Merck | 1049360250 | Transport solution: 10 Ca2+-free solution: 10 Enzyme solution E1 and E2: 10 Storage solution: 20 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Transport solution: 1.2 Ca2+-free solution: 1.2 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 Storage solution: 10 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M9397 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | Transport solution: 5 Ca2+-free solution: 5 Enzyme solution E1 and E2: 5 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Transport solution: 100 Ca2+-free solution: 100 Enzyme solution E1 and E2: 100 |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 | Transport solution: 50 Ca2+-free solution: 50 Enzyme solution E1 and E2: 50 Storage solution: 10 |
Collagenase I | Worthington | 4196 | Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml |
Protease XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml* |
pH | Transport solution: 7.00 Ca2+-free solution: 7.00 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 Storage solution: 7.40 |
||
adjusted with | Transport solution: 1 M NaOH Ca2+-free solution: 1 M NaOH Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH Storage solution: 1 M KOH |
||
Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only. | |||
Table I. Solutions. | |||
Company | Catalogue number | ||
Nylon mesh (200 μm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
Jacketed reaction beaker | VWR | KT317000-0050 | |
Table II. Specific equipment. | |||
Company | Catalogue number | ||
Dimethyl-sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fluo-3 AM (special packaging) | Invitrogen | F-1242 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM. | |||
Company | Catalogue number | Bath solution | |
4-aminopyridine* | Sigma-Aldrich | A78403 | Bath solution: 5 |
BaCl2* | Sigma-Aldrich | 342920 | Bath solution: 0.1 |
CaCl2 × 2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | Bath solution: 2 |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Bath solution: 10 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Bath solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Bath solution: 4 |
MgCl × 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | Bath solution: 1 |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | Bath solution: 140 |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | Bath solution: 2 |
pH | Bath solution: 7.35 | ||
adjusted with | Bath solution: 1 M HCl | ||
Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only. | |||
Company | Catalogue number | Pipette solution | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | Pipette solution: 92 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Pipette solution: 0.02 |
GTP-Tris | Sigma-Aldrich | G9002 | Pipette solution: 0.1 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | Pipette solution: 10 |
KCl | Merck | 1049360250 | Pipette solution: 48 |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Pipette solution: 1 |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Pipette solution: 4 |
Fluo-3** | Invitrogen | F3715 | Pipette solution: 0.1 |
pH | 7.20 | ||
adjusted with | 1 M KOH | ||
Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days. | |||