Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Molto di biologia cellulare avviene attraverso interazioni molecolari che coinvolgono DNA e RNA. ⁴ Questi acidi nucleici naturali (AN) interagiscono tra loro, ^{5, 6} con proteine ​​e con una serie di piccole molecole composti e ligandi in vivo (ad esempio, cationi bivalenti ^7). Le interazioni possono essere di breve o di lunga durata (cineticamente), può variare da elevata a moderata a bassa affinità (forza termodinamico), e può anche esporre sostanziale variazione delle proprietà chimiche e specificità – alcune associazioni sono molto specifici (ad esempio, il DNA · · · i fattori di trascrizione, RNA · · · fattori di splicing), mentre le altre interazioni sono necessariamente molto più generico (ad esempio, il DNA · · · batteriche come le proteine ​​istone-HU ^8). Non specifiche interazioni con agenzie nazionali possono avere conseguenze pratiche per gli esperimenti in vitro che coinvolgono miscele di biomolecules, in quanto è possibile, e anche probabile, che qualche AN assocerà con le biomolecole di interesse, almeno in alcuni sottoinsieme delle condizioni sperimentali impiegate (forza ionica, pH soluzione, ecc).

Si consideri, ad esempio, la produzione di una proteina di interesse (POI) eterologa tramite sovra-espressione della proteina ricombinante in coltura di cellule di Escherichia coli, tale procedura viene eseguita di routine in qualsiasi laboratorio di biologia strutturale ⁹ Nella preparazione per ulteriori esperimenti, quali. come caratterizzazione biochimica / biofisica, cristallizzazione, ecc., sforzi iniziali in genere in modo di ottenere una sufficiente quantità di POI come pura forma possibile, idealmente come un campione chimicamente omogenea e biofisico, monodisperse. Dopo la rottura di cellule ospiti, le prime fasi di un flusso di lavoro tipico purificazione lo scopo di isolare il POI da E. coli proteine, acidi nucleici, parete detriti cellulari,e altri componenti del lisato cellulare. Tuttavia, AN ospite può co-purificare con il POI per diversi motivi fisico – un POI fortemente basico può non specificamente tendina ospitante DNA / RNA, il POI può avere un generico NA attività di legame (ad esempio, il già citato HU); il POI può essere abbastanza specifico NA-binding protein ma mostra reattività crociata con RNA host o DNAs; ospitante AN può interagire con una matrice di cromatografia e quindi semplicemente co-eluire con il POI, e così via. Indiscriminato, ad alta affinità di legame di host AN verso un PDI può rappresentare un problema fastidioso in quanto le impurità NA probabilmente interferire con gli esperimenti a valle (ad esempio, analisi di anisotropia di fluorescenza di POI • RNA binding ^10). In alternativa, POI imprevisto · · · associazioni NA può essere visto anche fortuitamente, come tali interazioni illuminare il POI acido nucleico capacità di legame. In entrambi i casi, se AN sono componenti chiave o contaminanti, si deve prima quantificare eidentificare il tipo (DNA, RNA) di co-purificazione AN in preparazione per esperimenti a valle.

Esistono diversi metodi analitici per rilevare e quantificare AN in un campione. La maggior parte dei metodi disponibili sono fondamentalmente o spettrofotometrica (ad esempio, A ₂₆₀ valori di assorbanza e A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporti), fluorimetrica (ad esempio, il legame di tiazolo arancione o altri coloranti fluorescenti a NA), o colorimetrico (suscettibilità di nucleosidi a reazioni chimiche rendimento che cromofori assorbenti in UV-VIS regione dello spettro elettromagnetico), come recentemente descritto da De Mey et al. ¹ Tuttavia, il passo cruciale di identificare il tipo di polinucleotide come RNA o DNA è oltre la portata di molti di questi quantificazione approcci. Qui forniamo una serie di test colorimetrici di individuare rapidamente i tipi di componenti NA in un campione proteico.

I protocolli descritti qui cun essere efficacemente eseguito senza ulteriori fasi di isolare le impurità potenziali NA, e si basano su test Benedetto per zuccheri riducenti ^11, il saggio di orcinol pentosi ^{12,13, 14,15} e reazioni difenilammina di 2'-deoxypentoses (figure 1 e 2) . Test del Benedetto (Figura 2a) utilizza la capacità del lineare, forma a catena aperta (aldeide) di zucchero aldosio ridurre Cu ^{2 +,} con concomitante ossidazione del carbonile zucchero di una porzione carbossilato e produzione di Cu ₂ O come insolubile precipitato rosso. Questa reazione test positivo con libero zuccheri riducenti come aldosi e chetosi (che convertono le aldosi corrispondenti attraverso intermedi enediol), ma non con zuccheri pentosi che sono bloccati in forma ciclica come parte della spina dorsale covalente di un DNA o RNA polinucleotide. A causa del requisito minimalista di una funzionalità senza emiacetale, altri compounds che potrebbero test positivo in questo saggio – e quindi agiscono come potenziali interferenti – sono α-idrossi-chetoni e oligosaccaridi brevi (ad esempio il maltosio disaccaride). Sia il Bial di orcinol (Figura 2b) e Dische di difenilammina (figura 2c) reazioni sono basate sulla distruzione iniziale del backbone polinucleotide, tramite depurination del nucleoside e acido o ulteriore base-catalizzata idrolisi dei nucleotidi madri, per ottenere furan-2 -carbaldehyde (furfurolo) derivati; questi derivati ​​poi reagire sia con un poliidrossi fenolo come orcinol (Bial) o difenilammina (Dische di) reagenti per formare prodotti di condensazione colorate di struttura chimica in gran parte sconosciute. Il DNA RNA rispetto specificità del test del Dische deriva dal fatto che lo zucchero pentoso deve essere 2'-deossigenata per essere suscettibili di ossidazione per ω-hydroxylevulinyl aldeide, che reagisce ulteriormente con difenilamminain condizioni acide per ottenere un blu brillante condensa (figura 2c). Utilizzando i protocolli semplificati descritti qui, abbiamo trovato che queste reazioni colorimetriche zucchero-specifici può distinguere tra RNA e DNA, e indicherà la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio o in un campione biomolecolare.