Vi beskriver metoder for live-cell video mikroskopi av<em> Candida albicans</em> Fagocytose av makrofager. Med disse metodene kan scene-spesifikk analyse av macrophage migrasjon, anerkjennelse, engulfment og phagosome modning og avsløre nye sider ved fagocytose.
Fagocytisk klarering av sopp-patogener, og mikroorganismer mer generelt, kan bli vurdert for å bestå av fire forskjellige stadier: (i) overføring av fagocytter til området der patogener er plassert i, (ii) anerkjennelse av patogen-assosierte molekylære mønstre (PAMPs) gjennom mønsteret anerkjennelse reseptorer (PRRs), (iii) engulfment av mikroorganismer bundet til phagocyte cellemembranen, og (iv) behandling av omsluttet celler innen modning phagosomes og fordøyelse av inntatt partikkel. Studier som vurderer fagocytose i sin helhet er informative 1, 2, 3, 4, 5, men er begrenset ved at de normalt ikke bryte prosessen ned til migrasjon, engulfment og phagosome modning, som kan bli påvirket ulikt. Videre, slike studier vurdere opptak som en enkelt hendelse, snarere enn som en kontinuerlig dynamisk prosess. Vi har nylig utviklet avanserte live-cell imaging teknologi, og har kombinert disse med genetisk funksjonell analyse av bådepatogen og vert celler for å skape en tverrfaglig plattform for analyse av medfødte immunceller funksjon og sopp patogenesen. Disse studiene har avdekket nye sider ved fagocytose som bare kunne observeres ved hjelp systematisk timelige analyse av molekylære og cellulære interaksjoner mellom menneskelige fagocytter og sopp patogener og smittsomme mikroorganismer mer generelt. For eksempel har vi begynt å definere følgende: (a) komponentene i celleoverflaten kreves for hvert trinn av prosessen med anerkjennelse, engulfment og dreping av soppceller 1, 6, 7, 8, (b) hvor flategeometri påvirker effektiviteten av makrofag opptak og dreping av gjær og hyphal celler 7, og (c) hvor engulfment fører til endring av cellesyklusen og oppførselen makrofager 9, 10.
I motsetning til enkle tidspunktet øyeblikksbilder, muliggjør levende-celle video mikroskopi en rekke vertsceller og patogener studeres som continuous sekvenser over lengre tidsperioder, som gir romlig og tidsmessig informasjon om et bredt spekter av dynamiske prosesser, herunder celle migrasjon, replikering og vesicula menneskehandel. Her beskriver vi i detalj hvordan å forberede vert og sopp celler, og å gjennomføre video mikroskopi eksperimenter. Disse metodene kan gi en bruker-guide for fremtidige studier med andre fagocytter og mikroorganismer.
Her metoden for bruk av levende-celle video mikroskopi å studere macrophage fagocytose er beskrevet. Video mikroskopi tilbyr flere flere lag med informasjon for analyse. Ett grunnleggende fordel er at opptaks data kan genereres (fra ett enkelt eksperiment) for enhver tid punkt hele 6 hr observasjonsperioden. Enda viktigere, muliggjør metoden beskrevet differensial analyse av de individuelle faser av fagocytose. Vi har for eksempel vist at endringer i den samlede opptak av C. albicans glykosylering og morphogenesis mutanter ved macrophage cellelinjer og primære makrofager kan enten være en følge av endringer i makrofag migrasjon mot målceller eller rate av engulfment gang celle-celle kontakt er etablert 7.
Det finnes en rekke fallgruver du bør unngå når du utfører disse eksperimentene. Først, er det svært viktig å sikre stabile miljøforhold hele eksperimentelle prosedure. Dette oppnås best i et miljø kammer som er satt til de eksperimentelle forhold flere timer før oppstart av eksperimentet. Video kvaliteten er svært avhengig av avanserte moduler som bruker infrarøde lasere til automatisk opprettholde utvalg z-posisjon uansett mekaniske eller termiske endringer og dermed eliminere behovet for manuell fokusering korreksjoner.
Gitt den utvidede natur av forsøkene, er det viktig å begrense laserlys eksponering og tilknyttede fotobleking og photoconversion effekter, som kan minimeres ved anvendelse av svært fluorescerende markører som muliggjør lav eksponeringstider. FITC farging protokollen beskrevet her er rask og pålitelig. Som FITC er en svært lyse og stabil flekken, lav eksponering ganger er nødvendig, og dette gjør FITC ideell for lengre time-lapse filmer. Imidlertid vi rutinemessig bruke en rekke forskjellige mål flekker, inkludert Calcofluor White og PKH fargestoffer samt kodede organismer.
<p class = "jove_content"> De fleste av våre publiserte arbeider er utført ved en bred felt mikroskop, men eksponeringen kan bli ytterligere reduseres ved å bruke en roterende plate confocal mikroskop og i våre hender dette er viktig for time-lapse 3D-video mikroskopi.Under denne studien ble bilder tatt ved 1 minutts intervaller over en 6 timers fagocytose analysen. Intervallet mellom bildene kan justeres avhengig av prosessen under etterforskning. For eksempel, kan intervallet senkes når gransker raske prosesser som vesikulær handel. Minste tidsintervallet vil være begrenset av mikroskop og kamera spesifikasjoner. Det er noen hensyn å huske på når du justerer timings. Først, vil redusere intervallet mellom øyeblikksbilder bety færre poeng kan avbildes og filstørrelsen vil bli betydelig økt. Tvert imot, vil øke image intervallet for mye sminke filmen mister kontinuitet.
Denne tilnærmingen kan brukesi prinsippet å studere andre patogener og opptak av døende vertsceller. For eksempel har vi nylig vist at benmarg avledet makrofager fra sialoadhesin-mangelfull mus oppviser sterkt redusert binding og fagocytose av sialylated Campylobacter jejuni 8. Imidlertid er målstørrelse en viktig determinant for gjennomførbarhet, som bildeanalyse blir stadig vanskeligere med en reduksjon i målcellen størrelse. Sofistikert bildeanalyse programvare er viktig for rask video mikroskopi analyse, og dette bør kombineres med riktig bioinformatikk støtte til rette for produksjon av algoritmer for å studere migrasjon av individuelle celler og hele cellen bestander 7. Live-celle video mikroskopi i kombinasjon med avansert bildeanalyse programvare for minutt-for-minutt analyse av migrasjon og individuelle macrophage-C.albicans interaksjoner, gir en unik innsikt i kompleksiteten av C. albicans fagocytose ved macrophages. Det er et enormt potensial for å utvide disse metodene for å studere andre patogener og phagocytes (dendrittiske celler, nøytrofile) og å utvikle 3D video mikroskopi til bildet celle-celle interaksjoner i større detalj eller på flere fysiologiske overflater som epiteliale og endotelcelle lag. Denne teknikken er en del av neste generasjon av verktøy i studiet av host-patogen interaksjoner og vil hjelpe generere detaljerte romlig og tidsmessig informasjon om et bredt spekter av dynamiske prosesser.
The authors have nothing to disclose.
LPE er en skotsk Senior Clinical Fellow og erkjenner støtte fra Chief Scientist Office (SCD/03). Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust Project Grant til LPE (089 930). NARG ble finansiert av en Wellcome Trust Program Grant (080 088) og et utstyr Grant (075 470) (for DeltaVision), og ved en FP7-2007-2013 Grant (HELSE-F2-2010-260338-Allfun). Vi vil gjerne takke Universitetet i Aberdeen bildebehandling anlegget, spesielt Kevin MacKenzie, for nyttig støtte og råd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
NaOH | Sigma | S5881-500G |
Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
FITC | Sigma | F7250-1G |
Sodium carbonate | BDH | 301215M |
Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
PBS | Gibco | 18912-014 |
DMEM | Lonza | BE12-614F |
FCS | Life Technologies | 10106169 |
Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |