लाइव सेल कवक रोगज़नक़ phagocytosis के वीडियो माइक्रोस्कोपी
Summary
हम जीवित कोशिका वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए विधियों का वर्णन<em> Candida albicans</em> मैक्रोफेज द्वारा phagocytosis. इन विधियों बृहतभक्षककोशिका प्रवास, मान्यता घिराव, और फेगोसोम परिपक्वता के मंच विशिष्ट विश्लेषण सक्षम और phagocytosis के उपन्यास पहलुओं प्रकट.
Abstract
Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.
Protocol
Representative Results
Discussion
बृहतभक्षककोशिका phagocytosis अध्ययन के लिए जीवित कोशिका वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए विधि वर्णित है. वीडियो माइक्रोस्कोपी जानकारी के विश्लेषण के लिए कई अतिरिक्त परतों प्रदान करता है. एक बुनियादी लाभ यह है कि तेज डेटा 6 घंटा प्रेक्षण अवधि के दौरान किसी भी समय बिंदु के लिए एक ही प्रयोग से उत्पन्न किया जा सकता है. अधिक महत्वपूर्ण बात, वर्णित विधि phagocytosis के अलग – अलग चरणों के अंतर के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. हम, उदाहरण के लिए दिखाया गया है, कि सी. के समग्र तेज में परिवर्तन albicans और बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों और प्राथमिक मैक्रोफेज द्वारा ग्लाइकोसिलेशन morphogenesis म्यूटेंट या तो 7 स्थापित है बृहतभक्षककोशिका प्रवास में लक्ष्य सेल सेल के संपर्क में एक बार या निमग्नता की दर कोशिकाओं की दिशा में परिवर्तन का एक परिणाम हो सकता है.
नुकसान के एक नंबर से बचने के लिए जब इन प्रयोगों का आयोजन कर रहे हैं. सबसे पहले, यह बहुत महत्वपूर्ण है प्रयोगात्मक संस भर स्थिर पर्यावरण शर्तों सुनिश्चितdure. यह सबसे अच्छा है कि प्रयोग के शुरू होने से पहले कई घंटे प्रयोगात्मक शर्तों के लिए सेट कर दिया जाता है एक पर्यावरण कक्ष में हासिल की है. वीडियो की गुणवत्ता अत्यधिक परिष्कृत मॉड्यूल है कि अवरक्त लेजर का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से नमूना z-स्थिति बनाए रखने के यांत्रिक या थर्मल इस प्रकार मैनुअल ध्यान केंद्रित सुधार के लिए नष्ट करने की जरूरत है परिवर्तन की परवाह किए बिना पर निर्भर है.
प्रयोगों की विस्तारित प्रकृति को देखते हुए, यह महत्वपूर्ण है लेजर प्रकाश जोखिम और जुड़े photobleaching और photoconversion प्रभाव है, जो अत्यधिक फ्लोरोसेंट मार्करों, जो कम जोखिम बार की सुविधा को रोजगार के द्वारा कम किया जा सकता है सीमा. FITC धुंधला हो जाना यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल त्वरित और विश्वसनीय है. FITC है एक बहुत ही उज्ज्वल है और स्थिर दाग, कम जोखिम बार की जरूरत है और इस विस्तारित समय चूक फिल्मों के लिए FITC आदर्श बनाता है. हालांकि, हम नियमित रूप से Calcofluor व्हाइट और PKH रंगों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टैग जीवों सहित अलग लक्ष्य दाग की एक किस्म का उपयोग करें.
<p cलड़की = "jove_content" हमारे प्रकाशित काम के अधिकांश एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, लेकिन जोखिम आगे कताई डिस्क confocal खुर्दबीन कर और हाथ में इस समय चूक 3 डी वीडियो माइक्रोस्कोपी लिए आवश्यक है द्वारा कम जा सकता>.इस अध्ययन के दौरान, छवियों 1 मिनट के अंतराल पर एक 6 घंटा phagocytosis परख पर कब्जा कर लिया गया. छवियों के बीच के अंतराल में जांच के अधीन प्रक्रिया के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अंतराल जब ऐसे vesicular की तस्करी के रूप में तेजी से प्रक्रियाओं की जांच कम किया जा सकता है. न्यूनतम समय अंतराल माइक्रोस्कोप और कैमरा विनिर्देशों से सीमित हो जाएगा. वहाँ कुछ को ध्यान में रखना जब समय को एडजस्ट करने के लिए विचार कर रहे हैं. सबसे पहले, फोटो के बीच के अंतराल को कम करने का मतलब कम अंक और imaged किया जा सकता फ़ाइल का आकार काफी बढ़ जाएगा. इसके विपरीत, छवि अंतराल बहुत ज्यादा वृद्धि कर देगा फिल्म निरंतरता खोना.
इस दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता हैसिद्धांत रूप में अन्य रोगज़नक़ों का अध्ययन करने के लिए और मेजबान कोशिकाओं मरने की तेज. उदाहरण के लिए, हम हाल ही में पता चला है कि बोन मैरो sialoadhesin चूहों की कमी से व्युत्पन्न मैक्रोफेज बहुत बाध्यकारी और sialylated Campylobacter jejuni 8 phagocytosis कम प्रदर्शन. हालांकि, लक्ष्य आकार व्यवहार्यता के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है, के रूप में छवि विश्लेषण लक्ष्य सेल आकार में कमी के साथ तेजी से मुश्किल हो जाता है. परिष्कृत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर तेजी से वीडियो माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक है, और यह उपयुक्त जैव सूचना विज्ञान समर्थन के साथ मिलकर किया जाना चाहिए एल्गोरिदम की पीढ़ी के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं और पूरे सेल आबादी 7 के प्रवास अध्ययन की सुविधा. लाइव सेल मिनट दर मिनट माइग्रेशन और व्यक्तिगत बृहतभक्षककोशिका C.albicans बातचीत के विश्लेषण के लिए परिष्कृत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में वीडियो माइक्रोस्कोपी, सी. की जटिलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है macrophag albicans phagocytosisतों. वहाँ भारी करने के लिए इन तरीकों का विस्तार करने के लिए अन्य रोगज़नक़ों और phagocytes (वृक्ष के समान कोशिकाओं neutrophils) का अध्ययन करने के लिए और अधिक विस्तार में या उपकला और endothelial सेल परतों के रूप में अधिक शारीरिक सतहों पर छवि सेल सेल बातचीत के लिए 3 डी वीडियो माइक्रोस्कोपी विकसित की क्षमता है. इस तकनीक मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन में उपकरणों की अगली पीढ़ी का हिस्सा है और गतिशील प्रक्रियाओं की एक व्यापक रेंज पर विस्तृत स्थानिक और लौकिक जानकारी उत्पन्न करने में मदद करेगा.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE स्कॉटलैंड के एक वरिष्ठ क्लीनिकल फैलो और मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (SCD/03) के समर्थन मानता है. यह काम LPE (089,930) के लिए वेलकम ट्रस्ट परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. NARG एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम (080,088) अनुदान और एक उपकरण (075,470) ग्रांट (DeltaVision के लिए), और एक FP7-2007 2013 ग्रांट (स्वास्थ्य F2-2010-२६०३३८ – ALLFUN) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम Aberdeen इमेजिंग सुविधा के विश्वविद्यालय, विशेष केविन मैकेंज़ी में उपयोगी सलाह और समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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