Questo protocollo descrive il metodo di trappola gene inserzionale mutagenesi utilizzando Gal4-VP16 come giornalista primario e GFP / RFP come reporter secondarie in zebrafish. Circa uno su dieci-alta esprimendo F0 gene rendimento pesce trappola progenie co-esprimono GFP e RFP. La procedura di screening può essere facilmente scalata per adattarsi alle dimensioni del laboratorio che esegue lo schermo mutagenesi inserzionale.
Grandi dimensioni frizione e sviluppo esterno di embrioni otticamente trasparenti rendono zebrafish un eccezionale sistema modello vertebrato per la mutagenesi inserzionale in vivo con i giornalisti fluorescenti per contrassegnare espressione dei geni mutati. Diversi laboratori hanno costruito e collaudato vettori-enhancer e gene-trap in zebrafish, utilizzando proteine fluorescenti, attivatori trascrizionali basati lexA Gal4 e come reporter 1-7. Questi vettori avevano due possibili inconvenienti: rigore non ottimale (ad esempio, mancanza di capacità di distinguere tra gli eventi-enhancer e gene-trap) e bassa di mutagenicità (es. integrazioni in geni raramente prodotte alleli nulli). Gene Ultime Transposon (GBTS) sono stati sviluppati per affrontare questi inconvenienti 8-10. Abbiamo modificato uno dei primi vettori GBT, GBT-R15, per l'utilizzo con Gal4-VP16 come giornalista primario trappola genica e UAS aggiunto: eGFP come giornalista secondario per il rilevamento diretto di manifestazioni trappola gene. Lapplicazione di Gal4-VP16 come primario giornalista trappola genica offre due vantaggi principali. In primo luogo, essa aumenta la sensibilità per geni espressi a bassi livelli di espressione. In secondo luogo, consente ai ricercatori di utilizzare le linee trappola del gene come autisti GAL4 alla diretta espressione di altri transgeni nei tessuti molto particolari. Ciò è particolarmente pertinente per i geni con funzioni non essenziali o ridondanti, in cui l'integrazione trappola gene non può portare a fenotipi evidenti. Lo svantaggio dell'utilizzo GAL4-VP16 come primario giornalista trappola gene è che i geni che codificano per proteine con sequenze segnale N-terminale non sono suscettibili di cattura, come le proteine di fusione risultanti GAL4-VP16 è improbabile che siano in grado di entrare nel nucleo e attivano trascrizione. È importante sottolineare che l'uso di GAL4-VP16 non preselezionare per proteine nucleari: abbiamo recuperato mutazioni geniche intrappolare nei geni che codificano proteine che funzionano nel nucleo, citoplasma e membrana plasmatica.
Mutagenesi inserzionale ha dimostrato di essere un approccio efficace per dissezione funzione genica in diversi sistemi modello da organismi unicellulari come batteri e lieviti per gli organismi multicellulari come topi e piante. Qualsiasi DNA esogeno (virus, trasposone o plasmide) può servire come mutageno interrompendo elementi essenziali di geni come esoni o promotori. L'obiettivo efficace di tali approcci semplici è estremamente piccolo in grandi genomi complessi, poiché esoni comprendono solo 1-3% di un tipico genoma vertebrato. Piccole efficace dimensione di destinazione può essere superato da tassi di integrazione molto elevato vettoriali, come esemplificato dal grande successo di retrovirale mutagenesi inserzionale in zebrafish 11,12. Al contrario, introni costituiscono circa il 20-30% dei genomi di vertebrati. In zebrafish, a base di trasposoni, vettori di mutagenesi inserzionale che introducono efficacemente gravi mutazioni hypomorphic su integrazione-null o in introni sono stati chiamati "transposo gene di rotturans "(GBTS) 8-10. Per un'efficace integrazione trappola gene, usano un minimo Tol2 trasposone 13,14. Mutagenicità delle GBTS si basa su pesce di derivazione splice accettore e trascrizionali sequenze di terminazione / poliadenilazione. Gli elementi responsabili GBT mutagenicità si affiancano da siti loxP diretti di escissione da Cre ricombinasi. Così, l'iniezione di mRNA Cre porta alla reversione efficiente delle mutazioni GBT-indotte, anche se alcune sequenze trasposoni rimangono al locus integrazione 9,10.
I vettori GBT pubblicati recentemente usano MRFP come la trappola gene reporter 9,10, portando a due potenziali carenze. In primo luogo, non si sa quale frazione di geni di zebrafish sono espressi ad un livello abbastanza alto da essere rilevato da proteine giornalista di fusione fluorescenti diretti. In secondo luogo, solo un piccolo sottoinsieme di geni, dovrebbe avere funzioni essenziali. E 'stato stimato che ci sono solo 1,400-2,400 geni necessari per svilupp zebrafishnt 15,16. La maggior parte dei mutanti trappola gene non sono tenuti a visualizzare fenotipi evidenti e quindi avrà un'utilità limitata. Per superare queste due limitazioni, abbiamo modificato GBT-R15 9,10 da utilizzare con Gal4-VP16 come giornalista trappola gene primario (Balciuniene et al. In preparazione). Come con AUG-meno MRFP in GBT-R15, il sito di inizio della traduzione è stato rimosso dalla Gal4-VP16. Per il rilevamento diretto di eventi trappola gene, i nostri vettori contengono un reporter eGFP sotto il controllo di 14x Gal4 UAS 17,18.
Diverse caratteristiche aggiuntive sono state progettate nel nostro bipartito trappola gene vettore. Le scuole universitarie professionali: cassette eGFP è affiancato da un sito scalo FRT (chevrons grigio nella Figura 1). Iniezione di Flp ricombinasi mRNA porta ad escissione delle UAS: cassette eGFP, lasciando la mutazione del gene trappola smarcato da eGFP fluorescenza. Può quindi essere utilizzato in linee transgeniche che segnano specifici tessuti o eventi sviluppo di fluorescenza GFP. Come in altreGBTS, l'intera cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti loxP scalo (pentagoni aperti in Figura 1). Questo rende intercettare eventi gene reversibile mediante espressione di Cre ricombinasi, prontamente accertamento della prova di rapporto di causalità tra una determinata integrazione trappola gene e fenotipo osservato (Figura 2). Infine, la cassetta trappola gene è fiancheggiata da siti invertiti meganuclease I-SCEI (triangoli neri in Figura 1). In Drosophila, integrazioni trasposoni sono spesso convertiti in delezioni (carenze) per escissione impreciso dell'elemento P. Non ci sono prove che l'escissione del trasposone Tol2 (o qualsiasi altro trasposone attivo nei vertebrati come la Bella Addormentata, PiggyBac o Ac / Ds) può portare ad eliminazioni. Abbiamo quindi incluso siti I-SCEI come un potenziale metodo surrogato per l'induzione di delezioni, anche se non vi è alcuna prova che I-SCEI può indurre delezioni in zebrafish. Va notato che, mentre I-SCEI meganucleasi può essere utilizzato per facilitare transgenesi in zebrafish, taglio del DNA da I-SCEI meganuclease è utilizzata per studiare i meccanismi di riparazione del DNA, tra cui soggetto a errori non omologhe fine giunzione, nel lievito e cellule di mammifero 19-22.
Integrazione della nostra trappola gene vettore può portare ad espressione eGFP da due meccanismi differenti. Il primo è un vero e proprio evento trap gene (Figura 1C): il vettore integra in un gene (IMG per Insertionally gene mutato), una trascrizione fusione tra il 5 'del trascritto IMG endogeno e la Gal4-VP16 è realizzato e tradotto in un proteina di fusione contenente l'N-terminale della proteina codificata da IMG e GAL4-VP16. Questa proteina di fusione lega ai 14x UAS e attiva la trascrizione di eGFP. Il secondo evento, meno desiderabile è una trappola enhancer (Figura 1D): il promotore minimo davanti eGFP cade sotto il controllo di un enhancer vicino al sito di integrazione, che porta alla produzione di eGFP in abindicationi della produzione Gal4-VP16. Nella nostra stima, il 30-50% degli eventi di espressione eGFP sono dovuti ad una trappola enhancer e il 50-70% sono dovuti a una trappola gene 23 (Balciuniene et al. In preparazione). Per distinguere tra queste due classi di eventi, abbiamo fatto un 14xUAS: MRFP linea transgenica (Figura 1B), per comodità segnata da specifici lente γCry: (. Balciuniene et al, in preparazione) GFP. Intercettare eventi Gene vengono verificati da co-espressione di GFP e RFP (confrontare C e D in figura 2).
Nel nostro schermo pilota, abbiamo recuperato più di 40 eventi intercettare gene dopo lo screening di 270 F0 pesce iniettato con una miscela di DNA trasposone e transposase mRNA. Due dei nostri integrazioni trappola gene si sono verificati nei geni precedentemente pubblicati con mutanti indotti chimicamente: NSF e FLR. I fenotipi della nostra mutanti inserzionali tpl6 NSF e flr tpl24 sono superficialmente indistinguibili dal fenotipos dei corrispondenti mutanti indotti chimicamente. Abbiamo anche notato che gli eventi trap gene appaiono polarizzate verso gli introni vicino all'estremità 5 'dei geni, aumentando così la probabilità di alleli nulli. Facciamo osservare un certo grado di UAS silenziamento (variegatura) in tutte le nostre linee di trappola genica, e alcuni loci sono nettamente più sensibili alla variegatura di altri. Noi non crediamo che UAS silenziamento è un problema significativo per la propagazione delle linee trappola gene, come siamo stati in grado di propagare con facilità tutte le nostre linee di trappola genica attraverso almeno cinque generazioni selezionando per l'espressione GFP da sola.
I vettori trappola gene e la metodologia qui descritte sono già in uso in diversi laboratori indipendenti. Nella nostra esperienza, ci sono due fasi critiche del processo. Il primo passo fondamentale è quello di raggiungere elevati tassi di integrazione trappola gene in embrioni iniettati F0. Errore in questa fase può spesso essere attribuita alla contaminazione RNasi dei reagenti di iniezione, soprattutto al DNA miniprep. È inoltre molto importante per iniettare embrioni allo stadio 1 cellula per esperimenti trap gene. Nella nostra esperienza, la transgenesi mediata Tol2 è molto efficiente, che permette di ottenere linee transgeniche anche quando l'iniezione successiva alla fase 1 cella o con il DNA di qualità inferiore. Iniezioni incagliati sono molto più problematico quando svolgimento trappola gene mutagenesi, dal momento che solo una piccola frazione delle integrazioni vettoriali comporta efficaci intercettare gli eventi del gene. Il secondo passo fondamentale è quello di accertare intercettare gli eventi del gene attraversando il nostro UAS: linea MRFP. Assenza di espressione MRFP èquasi sempre indicativo di un evento trappola enhancer. Tuttavia, talvolta la mancanza di espressione MRFP può indicare silenziamento dei 14x UAS. E 'quindi importante mantenere le UAS: linea MRFP in uno stato non silenziato propagando la prossima generazione utilizzando gli individui con alta espressione RFP quando incrociate di tpl6 NSF.
Siamo in grado di prevedere facendo diversi miglioramenti per i nostri vettori intrappolare gene e il protocollo. Il primo è quello di utilizzare un UAS meno ripetitivo nel costrutto trappola gene. E 'stato dimostrato che un 5x UAS è sufficiente per raggiungere piena attivazione in esperimenti di coltura cellulare, e che le sequenze UAS meno ripetitive sono meno suscettibili di metilazione e silenziamento 6,25. Può anche essere possibile progettare vettori trappola gene per mutagenesi pienamente subordinata, in analogia con i vettori utilizzati dal mouse trappola gene consorzio internazionale e recentemente adattate zebrafish 2,26,27. Un altro miglioramento potrebbe essere quella di utilizzare un diverso tSistema ransposon, per esempio Sleeping Beauty 28, per generare un UAS: linea giornalista MRFP. Ciò consentirebbe iniezione di trappole gene basati Tol2 direttamente nella linea giornalista e lo screening di F0s da incrossing. Inoltre, verrebbe meno l'utilizzo di due differenti background genetico, rendendo l'interpretazione della perdita di fenotipi funzione più semplice. Anche con questi miglioramenti, il Gal4 protocollo trappola gene generale presentata qui sarebbe ancora pienamente applicabile.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dott. Jennifer Emtage per la lettura critica del manoscritto, Ryan Gill per l'assistenza tecnica e aiutare con cura zebrafish e il Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) per i reagenti. Il nostro lavoro è stato sostenuto da Temple University College di Scienza e Tecnologia e il National Institutes of Health (R01-HD061749).
Name of the Reagent/Material | Company | Catalog # | Comments |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Optional PB wash step is a must |
XbaI restriction enzyme | ThermoFisher | ER0681 | |
mMessage Machine T3 | Ambion | AM1348 | |
RiboLock RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
RNeasy MinElute | Qiagen | 74204 | Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl! |
Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | Has to be non-DEPC treated |
Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microcapiliaries for calibration | Drummond Scientific | 1-000-0010 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
Needle puller * | Sutter Instruments | P-87 | |
Stereomicroscope for microinjection * | Nikon | SMZ1500 | We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand |
Picoinjector * | Harvard Instruments | Pli-90 | We also use Pli-100 |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Zeiss | Zeiss AxioImager | 5X Fluar objective has sufficient working distance |
Screening microscope with GFP/RFP fluorescence * | Nikon | SMZ1500 | |
* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available. |