Um modelo de camundongo ortotópico de Carcinoma anaplásico da tiróide

1. Preparação celular Notas: 1) Formulação completo RPMI 1640 com base meios de cultura (500 ml), compreende 435 ml de RPMI 1640, 50 ml de FBS inactivado pelo calor, 5 ml de aminoácidos não essenciais, 5 mL de piruvato de sódio, 5 ml de antibiótico-antimicótico, 2) lugar matrigel a 4 ° C, um dia antes da colheita de células. Human linha celular ATC THJ-11T 8 são cultivadas em placas de cultura de 6 poços e colhido uma vez 80-90% confluentes. Células por centrifugação a 200 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o meio e ressuspender as células em meio RPMI 1640 [2 ml / placa de 6 poços]. Tomar um pequeno volume da suspensão de células, adiciona-la a um volume de 0,4% de corante azul de tripano e determinar a densidade das células usando TC10 contador de células automatizado. Calcular o volume de suspensão de células necessário para obter 5 x 10 5 células / mouse vezes os ratos número injetáveis. Nota: Para garantir anúncio equiparar suspensão de células para injeção, preparar as células como se você está injetando o dobro do número de ratos (por exemplo, se injetando 5 ratos, em seguida, preparar suspensão celular como se estivesse injetando 10 ratos). Transferir necessário volume de suspensão de células para um tubo cónico de 15 ml. Células por centrifugação a 200 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente. Aspirar mídia e Ressuspender as células em RPMI completo 1640. Transferência de células para um tubo de 1,6 ml, adicionar um volume de matrigel e misture delicadamente por pipetagem lentamente dentro e para fora. Nota: Cada ratinho recebe 10 uL da suspensão / matrigel cocktail célula. Desde 5 x 10 5 células em suspensão em um volume de 10 ul injectável ter sido usado com sucesso em estudos anteriores ATC ortotópicos 9-10, foram utilizados os parâmetros neste relatório. Coloque suspensão de células em gelo até que esteja pronto para uso. _title "> 2. Preparação Rato Limpar a zona cirúrgica, que inclui o âmbito de dissecação e área circundante, limpando as superfícies com etanol a 70%. Ligar lâmpadas de aquecimento / almofadas onde os animais serão recuperando de uma cirurgia. Administrar 0,1 ml de cetamina / xilazina (coquetel de drogas consistindo em cetamina 9 mg / ml de xilazina e 1mg/ml) por 10 g de peso corporal por via intraperitoneal usando um 1 ml, 27G ½ "seringa de tuberculina. Prep rato para a cirurgia: 1) barbear pescoço de rato (de linha da mandíbula ao topo do esterno e para os braços), 2) esfregar área cirúrgica três vezes com chorhexadine quadrados gaze embebida, 3) esfoliação último feito com betadine gaze embebida, 4 ) aplicar suavemente pomada para evitar que os olhos sequem. Verifique pedal reflexo para garantir rato está adequadamente sedado. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma barreira de campo estéril descartável no âmbito de dissecação e garantir o animal no lugar com fita de tecido. Esfrega as mãos e os fingernails em seguida, colocar luvas cirúrgicas estéreis. De uma forma estéril, a cirurgia aberta embalar e organizar instrumentos. Coloque cortina estéril sobre animal, deixando apenas sítio cirúrgico exposto. 3. O acesso cirúrgico à tireóide e injeção de células Usando um estéril, bisturi descartável, fazer uma incisão longitudinal de 1 a 1,5 centímetros ao longo da linha média do pescoço. Nota: Desvio da linha média complica mais profundo corte de acesso à traquéia. Bastante incisão precisa mediana permite brincar e cortar o tecido membranoso segurando glândulas salivares esquerdo e direito juntos e reduz a chance de entalhar ou cortar grandes artérias. Faça uma segunda incisão nos músculos da cinta ao redor da traquéia, em seguida, puxe o lado direito do músculo incisão para o lado para expor a glândula tireóide direita. Hemostats podem ser usadas neste ponto para segurar a camada de músculo umparte de fácil acesso para a glândula tireóide (Figura 1). Nota: Como alternativa, se o procedimento realizado por duas equipes cirúrgicas, a camada muscular pode simplesmente ser detido com uma pinça, enquanto uma seringa injetável pronto é entregue ao cirurgião pela equipe auxiliar. Lentamente, injetar 10 ml de suspensão de células na glândula tireóide direita usando um 31G 5/16 "seringa de insulina, em seguida, retire cuidadosamente a agulha. 4. Fechamento da ferida cirúrgica e recuperação Rato Camada muscular da sutura com material de sutura 6.0 usando um modelo de sutura contínua ou interrompida. Costure a pele da mesma forma. Aplique uma camada de pomada antibiótica tripla directamente sobre o local da incisão. Permitir animal a se recuperar em decúbito dorsal sobre almofada de aquecimento quente. Uma vez que animal pode atingir decúbito esternal sem ajuda, ele pode ser colocado de volta com outros ratos. <p class = "jove_title"> 5. Acompanhamento pós-operatório e coleta de tecido Verifique o local da incisão e de saúde geral do animal diariamente durante uma semana após a cirurgia, em seguida, verifique uma vez por semana. Se as suturas são ainda intactas após 14 dias, elas são removidas. Nota: Os animais que apresentem sinais de declínio da saúde (por exemplo, perda de peso substancial, cabelo desalinhado, dificuldade para respirar) devem ser sacrificados e os tecidos coletados. Uma vez que os ratos chegaram a um pós-operatório ponto de tempo pré-determinado, administrar cetamina / xilazina como descrito acima para sedar. Perfundir animais intracardially e colheita da tireóide / traquéia e outros tecidos de interesse (não descrito em detalhes aqui).