Un modèle de souris orthotopique de cancer de la thyroïde anaplasique

1. Préparation des cellules Notes: 1) RPMI 1640 complet basé sur la culture recette médias (500 ml) contient 435 ml de RPMI 1640, 50 ml chaleur FBS inactivé, 5 ml d'acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium à 5 ml, 5 ml antibiotique antifongique; 2) le lieu matrigel à 4 ° C un jour avant la récolte des cellules. Lignée cellulaire humaine ATC THJ-11T 8 sont cultivées dans des plaques de culture 6 puits et récolté une fois à 80-90% de confluence. Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 4 min à température ambiante. Aspirer les médias et suspendre les cellules dans du RPMI 1640 [2 ml / 6 plaque bien]. Prenez un petit volume de la suspension cellulaire, l'ajouter à un volume de 0,4% de colorant bleu trypan et déterminer la densité cellulaire à l'aide TC10 Compteur de cellules automatisé. Calculer le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour obtenir 5 x 10 5 cellules / souris fois le nombre des souris par injection. Note: Pour assurer annonce synonyme suspension cellulaire pour injection, préparer des cellules comme si vous vous injectez le double du nombre de souris (par exemple si l'injection de 5 souris, puis préparer une suspension cellulaire comme si vous étiez en injectant 10 souris). Transfert volume nécessaire de la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 g pendant 4 min à température ambiante. Aspirer les médias et suspendre les cellules dans complètes 1640 RPMI. Transférer les cellules dans un tube de 1,6 ml, ajouter 1 volume de Matrigel et mélanger doucement par pipetage lentement dans et hors. Note: Chaque souris recevra 10 pl de la suspension / matrigel cocktail cellulaire. Depuis 5 x 10 5 cellules en suspension dans un volume injectable 10 ul ont été utilisés avec succès dans l'ATC précédentes études orthotopiques 9-10, nous avons utilisé ces paramètres dans le présent rapport. Placez suspension cellulaire sur la glace jusqu'au moment de servir. _title "> 2. Préparation souris Nettoyez la zone chirurgicale, qui comprend la dissection et la région avoisinante, en essuyant toutes les surfaces avec de l'éthanol à 70%. Allumez les lampes / coussins chauffants où les animaux seront en convalescence. Administrer 0,1 ml de kétamine / xylazine (cocktail de médicaments composé de kétamine à 9 mg / ml et xylazine 1mg/ml) par 10 g de corps par voie intrapéritonéale de poids en utilisant un 1 ml, 27G ½ "seringue tuberculine. Prep souris pour la chirurgie: 1) Se raser la région du cou de la souris (de la ligne de la mâchoire en haut du sternum et sur les armes), 2) frotter zone chirurgicale trois fois avec chorhexadine carrés de gaze imbibées, 3) gommage finale fait avec de la bétadine gaze imbibée, 4 ) appliquer doucement la pommade oculaire pour éviter les yeux de sécher. Vérifiez la pédale réflexe pour assurer la souris est correctement mis sous sédation. Placez animaux en décubitus dorsal sur une barrière de champ stérile à usage unique dans le champ de dissection et de sécuriser l'animal en place avec du ruban adhésif en toile. Scrubs mains et fingernails puis mettre des gants chirurgicaux stériles. D'une manière stérile, la chirurgie ouverte emballer et organiser instruments. Placez champ stérile sur animal, ne laissant que le site chirurgical exposée. 3. Surgical accès à la thyroïde et l'injection de cellules Utilisation d'un stérile, jetable scalpel, faire une incision longitudinale de 1 à 1,5 cm le long de la ligne médiane de la gorge. Note: Déviation de la ligne médiane complique plus profond de coupe pour accéder à la trachée. Assez incision médiane précis vous permet de taquiner et de couper à travers le tissu membraneux tenant glandes salivaires gauche et droite ensemble et réduit les risques de entailler ou couper les grandes artères. Faire une deuxième incision dans les muscles de la sangle entourant la trachée puis tirez le côté droit du muscle incisé sur le côté pour exposer la glande thyroïde droit. Hémostatiques peuvent être utilisés à ce stade de maintenir la couche musculaire uneune partie pour un accès facile à la glande thyroïde (figure 1). Remarque: Par ailleurs, si la procédure effectuée par deux membres du personnel chirurgical, la couche musculaire peut simplement être freinée avec une pince alors une seringue injectable prêt est remis au chirurgien par le personnel d'assistance. Injecter lentement 10 pl de suspension cellulaire dans la glande thyroïde droite à l'aide d'un 31G 5/16 "seringue d'insuline puis retirez délicatement l'aiguille. 4. Fermeture du site opératoire et la récupération de la souris couche musculaire de suture avec 6,0 matériau de suture en utilisant soit un modèle de suture continue ou discontinue. Piquer la peau de la même façon. Appliquer une couche de pommade antibiotique triple directement sur le site d'incision. Autoriser l'animal à récupérer en décubitus dorsal sur coussin chauffant chaud. Une fois animal peut atteindre décubitus sternal sans assistance, il peut être placé en arrière avec les autres souris. <p class = "jove_title"> 5. Le suivi post-opératoire et Tissue Collection Consultez le site de l'incision et la santé générale de l'animal tous les jours pendant une semaine après la chirurgie, puis vérifier une fois par semaine. Si les sutures sont encore intactes après 14 jours, ils sont supprimés. Remarque: Les animaux présentant des signes de détérioration de la santé (par exemple, perte de poids importante, les cheveux débraillés, respiration laborieuse) devrait être euthanasié et tissus collectés. Une fois les souris ont atteint un point dans le temps post-opératoire prédéterminé, administrer la kétamine / xylazine comme décrit ci-dessus pour endormir. Perfuser animaux intracardiaque et la récolte thyroïde / trachée et autres tissus d'intérêt (pas décrite en détail ici).