Подготовка опухолевый антиген нагруженных Зрелые дендритные клетки иммунотерапии
Summary
Наиболее часто используемый способ генерирования большого количества аутологичных дендритных клеток (DC) для использования в иммунотерапии опухолей описано. Метод использует IL-4 и GM-CSF дифференцировать ДК из моноцитов. Незрелые ДК стимулируются, чтобы созреть и затем загружается с антигенами, прежде чем они вводятся обратно в организм пациента.
Abstract
Хотя клинические исследования установили, что антиген-DC загруженных вакцины безопасны и перспективным для терапии опухолей 1, их клиническая эффективность еще предстоит установить. Метод, описанный ниже, подготовленной в соответствии с правилами процесса производства (GMP) руководящие принципы, является оптимизацией самых распространенных бывших естественных условиях подготовки способ генерации большого количества контроллеров домена для клинических исследований 2.
Наши способе используют синтетический агонист TLR 3 Полиинозиновую-полицитидилова кислота-поли-L-лизин-карбоксиметилцеллюлоза (Поли-ICLC), чтобы стимулировать DC. В предыдущем исследовании было установлено, что Poly-ICLC является самым мощным стимулом отдельных созревание для человека РС по оценке регуляция CD83 и CD86, индукции интерлейкина-12 (IL-12), фактор некроза опухолей (ФНО), интерферон гамма-индуцированной белок 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), интерфероны типа I (IFN) и минимальное интерлейкин-10 (IL-10) производства. </p>
ДК отличаются от замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученного лейкаферез. РВМС выделяли центрифугированием в градиенте Ficoll и замораживают в аликвотах. В день 1 РВМС оттаивали, засевали на колбах культуры тканей, чтобы выбрать для моноцитов которые прилипают к пластиковой поверхности через 1-2 ч инкубации при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур. После инкубации лимфоцитов смываются и прилипшие моноциты культивировали в течение 5 дней в присутствии интерлейкина-4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) дифференцироваться в незрелые ДК. На 6-й день, незрелые ДК импульсно гемоцианин лимфы улитки (KLH) белок, который служит в качестве контроля качества вакцин и может повысить иммуногенность вакцины 3. ДК стимулируются, чтобы созреть, нагруженных пептидных антигенов, и инкубировали в течение ночи. На 7 день, клетки промывают и замораживают в аликвотах 1 мл, содержащих4 – 20 × 10 6 клеток с использованием контролируемой скорости морозильной камеры. Лот тестирования расцепителя для партий ДК выполняется, и должны соответствовать минимальным требованиям, прежде чем они вводят пациентам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фазы I и II клинических испытаний, полученных из моноцитов ДК показали, что они индуцируют иммунный ответ у пациентов, однако клинический успех был ограничен 1. Частично это может быть связано с отсутствием консенсуса о том, как для формирования оптимального РСУ иммунотерапевтичес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Андрес Салазар (Oncovir, Inc) за дар Poly-МКПЦН.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. 암 연구학. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
