Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protezione contro le malattie infettive è mediato dal sistema immunitario ^1,2. Linfociti T sono coordinatori del master del sistema immunitario, regolando l'attivazione e risposte di molteplici cellule immunitarie ^3,4. Attivazione delle cellule T dipende dal riconoscimento di antigeni specifici mostrata dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) è specifico per ogni clone di cellule T e determina specificità antigenica ^5. Il legame del TCR all'antigene induce la fosforilazione di componenti del complesso TCR. Al fine di promuovere l'attivazione delle cellule T, questo segnale deve essere trasdotte dalla membrana al citoplasma e il nucleo, avviando varie risposte cruciali quali l'assunzione di proteine ​​di segnalazione al TCR; sito APC (sinapsi immune), la loro attivazione molecolare, riarrangiamento del citoscheletro, elevazione della concentrazione intracellulare di calcio, e cambiamenti nell'espressione genica ^6,7. La corretta initiation e la cessazione dei segnali di attivazione è di fondamentale importanza per le risposte delle cellule T del caso. L'attività delle proteine ​​di segnalazione dipende la formazione e la terminazione di interazioni proteina-proteina, post traduzionali come fosforilazione proteica, formazione di complessi proteici, ubiquitinazione proteica e l'assunzione di proteine ​​a vari siti cellulari ^8. Comprendere il funzionamento interno del processo di attivazione delle cellule T è fondamentale sia per la ricerca immunologica e applicazioni cliniche.

Vari test sono stati sviluppati al fine di indagare le interazioni proteina-proteina, tuttavia, saggi biochimici, come ad esempio il metodo di co-immunoprecipitazione ampiamente utilizzato, non consentono posizione proteina di essere discerne, precludendo così l'osservazione di preziose informazioni sulla dinamica del cellulare meccanismi. Inoltre, questi test di massa di solito si combinano proteine ​​da molte cellule diverse che potrebbero essere in diverse fasi di tindagò processo cellulare. Questo può avere un effetto negativo sulla risoluzione temporale. L'uso di immagini in tempo reale delle cellule vive permette sia il tracking spaziale delle proteine ​​e la capacità di distinguere temporalmente tra eventi di segnalazione, che perde così in luce la dinamica del processo di ^9,10. Presentiamo un metodo di imaging in tempo reale della formazione di segnalazione-complesso durante l'attivazione delle cellule T. T-cellule primarie o linee di cellule T, come Jurkat, vengono trasfettate con plasmidi codificanti per proteine ​​di interesse fuse ad proteine ​​fluorescenti monomeriche, impedendo oligomerizzazione non fisiologico ^11. Diretta cellule T sono sceso sopra un coprioggetto pre-rivestite con cellule T attivante ^8,9 anticorpo, che si lega al complesso CD3/TCR, indurre l'attivazione delle cellule T superando la necessità di antigeni attivatori specifici. Cellule attivate sono costantemente ripreso con l'uso della microscopia confocale. Dati di imaging vengono analizzati per produrre risultati quantitativi, quali il collecoefficiente ocalization delle proteine ​​di segnalazione.