Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Alle Experimente wurden nach der University of Ottawa Vorschriften für tierische Pflege und Handhabung behandelt. Siehe Tabelle 1 für einen Überblick über das Protokoll. Ein. Vor dem Starten der Isolation Bereiten Sie die folgenden Lösungen: 0,2% Collagenase Typ I in DMEM (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, hohe Glukose, L-Glutamin mit 110 mg / ml Natriumpyruvat). EDL für zwei Muskeln vorzubereiten 2 ml 0,2% Collagenease in DMEM. Die Lösung wird durch einen 0,22 um-Filter. 10 min vor der Isolierung, vorwärmen auf 37 ° C im Wasserbad. Zusätzliche Aliquote unverdünnten Collagenase kann bei -20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Anmerkung: Mit DMEM mit Natriumpyruvat in allen der Prozedur. Fasern nicht in Natriumpyruvat-freiem Medium überleben. Waschen Medien (verwenden, um alle Wäschen durchführen). DMEM ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin. Anschließend wird durch 00,22 um-Filter vor dem Gebrauch. Myofiber Kulturmedien. Supplement DMEM mit 20% FBS, 1% Hühnerembryo-Extrakt und 1% Penicillin / Streptomycin. Filtern durch 0,22 um-Filter vor dem Gebrauch. Matrigel beschichteten Schalen. Um Kultur Fasern für längere Zeit, empfehlen wir die Verwendung Matrigel als Beschichtung Substrat. Um Matrigel beschichteten Gerichte zubereiten, tauen ein Aliquot Matrigel bei 4 ° C über Nacht. Am Tag nach verdünnen Matrigel 1:10 in DMEM. Halten Matrigel bei 4 ° C zu allen Zeiten und vermeiden abrupte Temperaturänderungen da dies mikroskopischen Kristallen innerhalb der Matrigel-Lösung, was zu einer ungleichmäßigen Beschichtung zu schaffen. Ort Gerichten auf Eis überzogen werden. Coat Gerichte mit gerade genug Volumen, um die Oberfläche zu bedecken. Lassen Sie es für 1 min sitzen. Vollständig zu entfernen die übrig gebliebenen Matrigel. Lassen Sie Speisen trocken bei 37 ° C für mindestens 3 Stunden vor dem Gebrauch oder über Nacht. Hinweis: Aliquots der verdünnten Matrigel kann mehrfach für die Beschichtung Zweck wieder verwendet, wenn bei 4 & de gespeichertg; C. Schließlich sollten Sie das Mikroskop Station und Sezieren Werkzeuge mit 70% Ethanol reinigen. Für zwei EDL Isolationen (eine Maus) vorzubereiten fünf Kunststoff-Petrischalen (60 * 15mm) wie folgt: Vier Gerichte für die Isolierung (1 für Muskel-Dissoziation, 3 für serielle Wäschen). Alle Gerichte müssen mit Pferdeserum (HS) beschichtet werden, um Muskelfasern von der Befestigung auf Kunststoff zu vermeiden. Zu beschichten, Pipette 3 ml Pferdeserum in jede Schale, wirbeln um eine gleichmäßige Beschichtung zu ermöglichen, entfernen Sie das Pferdeserum und lassen die Schale trocken für mindestens 30 min. 4 ml DMEM zu jedem Gericht. Halten Schalen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator vor dem Gebrauch. Hinweis: Pferdeserum kann mehrfach wiederverwendet werden, wenn steril gehalten. Alternativ kann eine Lösung von 10% HS in DMEM zu beschichten Speisen verwendet werden. Verwenden HS beschichtete Platten während des gesamten Protokolls und bei der Kultivierung Muskelfasern auf schwimmenden Bedingungen. Ein Gericht wird zu Kultur Muskelfasern nach der Isolierung verwendet werden. Alternative Teller Größen oder Formate können für die endgültige Kultur der Muskelfasern abhängig Downstream-Anwendungen verwendet werden. Allerdings wissen wir nicht vorschlagen, Teller Größen größer als 60 * 15mm. Muskelfasern können in Suspension nicht länger als 96 Stunden aufbewahrt werden, bevor hyper Kontraktion auftritt. Für mehr Kultur Zeiten, empfehlen wir die Verwendung Matrigel beschichteten Schalen oder Platten. Für eine Faser Trennung (2 EDL), bereiten zwei sterile Pasteur Pipetten: eine große Bohrung Pipette für Muskel-Handling und eine kleine Bohrung Pipette für myofiber Manipulation. Verwenden Sie ein Diamant-Stift, um jede Glaspipette auf die gewünschte Länge und Wärme polieren Pipette Kanten zu glätten geschnitten. Durch die Verwendung der Flamme, Kurve die Spitze des kleinen Bohrung Pipette. Dies wird dazu beitragen die Handhabung einzelner Fasern. Flamme zu sterilisieren. Coat jede Pipette mit HS vor dem Gebrauch. 2. Muscle Dissection und Verdauung Für den Zweck dieser Experimente, 8 Wochen alt SV129, Pax7 Creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) und Myf5-Cre; Rosa26YFP verwendet wurden. Sprühen Hinterbeine mit 70% Ethanol. Merken das Tier (face up) auf einer Trägerplatte, um ein besseres Verständnis der Hintergliedmaße während des Verfahrens haben. Mit Hilfe der Schere, durch die gesamte Länge des Gliedes schneiden und legen das darunterliegende Muskel. Entfernen Sie die Haut sowie keine Haare oder Fell (Abbildung 1A). Mit einer feinen Schere, durch die dünne Faszie geschnitten, ohne die darunter liegenden Muskeln. Optisch zu lokalisieren die EDL. Die EDL ist im vorderen Fach des Hinterbein knapp unterhalb des Tibialis Anterior (TA) Muskel gefunden. Mit Hilfe von zwei Zangen, setzen die distalen Sehnen. Schneiden Sie den distalen Sehnen (sowohl der TA und EDL) mit scharfen Cohann-Vannas Frühjahr Schere. Mit Hilfe einer Zange halten sowohl TA und EDL Muskeln durch ihre Sehnen und zart ziehen Sie die Muskeln um bis zum proximalen Ende. An diesem Punkt sollten Sie in der Lage sein, klar zu sehenDie EDL Muskel knapp unterhalb der TA Muskel. Jetzt trennen die EDL aus der TA Muskel durch Ziehen an den beiden Sehnen in entgegengesetzte Richtungen (Abbildung 1B). Vermeiden Sie Dehnen der EDL Muskel während Sie diesen Vorgang ausführen, da dies die Muskelfasern beschädigt wird. Setzen Sie die EDL Sehne. Zur besseren Visualisierung der proximalen Sehne kann es an dieser Stelle helfen, die TA Muskel zu entfernen. Es kann auch helfen abzuschneiden einige das Bindegewebe um das Knie (Abbildung 1C). Schneiden Sie die proximale Sehne und entfernen Sie vorsichtig die EDL (1D). Durch Halten des Muskels durch ihre Sehnen, dann in 2 ml des zuvor hergestellten Kollagenaselösung. Bei 37 ° C im Wasserbad. Hinweis: Isolierung für erfolgreiche Faser, ist es wichtig, die EDL aus Sehne-Sehne so isolieren, daß die myofiber Integrität aufrechterhalten wird. Schritte können von 2,3 bis 2,9 unter einem Präpariermikroskop durchgeführt werden. Alternativ kann die Verwendung eines magndern, indem Glas kann auch dazu beitragen, eine bessere Sicht auf die Muskeln. Wiederholen Sie die Schritte von 2,3 bis 2,9, die zweite EDL zu isolieren. Übertragen Sie die zweite EDL in das gleiche Rohr. Um ungleichmäßige Verdauung zu vermeiden, sollte die Isolierung des zweiten EDL nicht mehr als 5 min nach dem ersten auszufüllen. Hinweis 1: Inkubationszeit muss möglicherweise angepasst je nach Kollagenase-Aktivität werden. Längere oder kürzere Inkubationszeit ist möglicherweise erforderlich, je nach Größe, Alter und / oder Muskel-Zustand (zB fibrotische Muskeln brauchen mehr Verdauung Zeit). Hinweis 2: Wenn die Prüfung Satelliten-Zellen Verhalten unter quiescence Bedingungen Agitation während Muskel Aufschlusszeit aktivieren können Satelliten-Zellen 10. Während der Verdauung Zeit, regelmäßig zu überprüfen, den Muskel über-Verdauung zu vermeiden. Stoppen Sie die Verdauung, wenn die Muskeln zu lockern beginnen und Muskelfasern sind sichtbar. Zur Verdauung zu stoppen, transferieren es vorsichtig in beide Muskeln eine vorgewärmte Petrischale mit 4 ml DMEM (dissociatiauf Teller). Nutzen Sie den großen Bohrung Pipette, um diesen Vorgang durchzuführen. Hinweis: Vermeiden Sie Muskeln overdigestion da dies unweigerlich in der Isolation hyper vertraglich Muskelfasern. 3. Einzel Myofiber Dissoziation und Kultur Um Muskelfasern freizugeben, verwenden Sie die große Bohrung Glaspipette, um den Muskel mit warmem Medium spülen, bis Fasern natürlich beginnen freigegeben wird. Nicht verreiben den Muskel, da dies zwangsläufig schädlich Fasern führen. Führen Sie diese und die folgenden Schritte unter einem Binokular. Weiter Loslassen Muskelfasern, bis die gewünschte Zahl erreicht ist. Wenn der Teller bei Raumtemperatur für mehr als 10 min erforderlich erlauben eine 5 min (minimale) Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 wieder äquilibrieren das Medium. Anmerkung: Wenn Füllgut bis Temperaturen unter physiologischen (37 ° C) über einen längeren Zeitraum Muskelfasern wird sterben. Mit der geringen Größe Bohrung Pipette transfer leben einzelnen Muskelfasern zu einer neuen vorgewärmte Schüssel (erste von drei aufeinanderfolgenden Waschungen). Fassen myofiber individuell statt der Übertragung Großteil der Muskelfasern auf einmal. Falls erforderlich, Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 bis 15 min erneut äquilibrieren das Medium. Wiederholen Sie Schritt 3,3 für 2 weitere Male oder bis alle tot Muskelfasern und Schmutz entfernt werden. Wir empfehlen mindestens drei aufeinanderfolgenden Waschungen für eine ordnungsgemäße Reinigung. Hinweis: dead Muskelfasern erscheint so kurz und hyper Vertrag unter dem Mikroskop Licht. Inkubieren einzelnen Muskelfasern bei 37 ° C, 5% CO 2 in der letzten Waschung Näpfe (DMEM nur) für mindestens eine Stunde vor dem Umschalten in Kulturmedium. Dies ermöglicht Muskelfasern um die in vitro-Bedingungen in Abwesenheit von Serum einzustellen. Wir fanden, dass die sofortige Kultur der Muskelfasern im Serum Vollmedium erhöht Faser Schrumpfung. Nach einer Stunde, übertragen Muskelfasern zu einer neuen vorgewärmten Teller oder in den entsprechenden Kultur-Formatin Abhängigkeit von der stromabwärts Anwendung. Kultur Fasern in hoher Serum-Medium zu ermöglichen Satelliten-Zell-Aktivierung. Alternativ können unterschiedliche Konzentrationen von Serum oder Hühnerembryo-Extrakt eingesetzt werden. Ändern Medium jeden zweiten Tag. 4. Downstream-Anwendungen Immunfärbung. Live Muskelfasern festlegbar und zu jedem Zeitpunkt angefärbt werden während der Isolierung. Immunfluoreszenz kann sowohl schwimmend und Substrat-attached Muskelfasern durchgeführt werden. Wenn Flecken floating Muskelfasern, verwenden Sie eine kleine Bohrung Glaspipette um Muskelfasern von einer Lösung auf ein anderes übertragen. Alternativ ist es möglich, in der gleichen Muskelfasern gut halten im ganzen Verfahrens und Hinzufügen / Entfernen von Lösungen unter Verwendung einer Glaspipette. Vermeiden Standard Aspiration da dies die Entfernung der Muskelfasern sowie führt. Kurz gesagt, vollständig zu entfernen Kulturmedium; fix Muskelfasern in vorgewärmten 4% Paraformaldehyd (PFA) für 5 min. Weitgehend in PBS mehrmals waschen. Incubate Muskelfasern in 1% Glycin in PBS oder andere Standard-Abschrecken Lösungen zur Minimierung PFA Hintergrundfärbung. Falls erforderlich, permeabilisieren Muskelfasern mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 min durch einen 5 min Waschschritt in PBS. Inkubieren Fasern in Blockierungslösung (10% Pferdeserum, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) für 1 h bei Raumtemperatur oder vorzugsweise über Nacht bei 4 ° C. Alternative Blockierungslösungen können verwendet werden, abhängig von der Antikörper von Interesse. Waschen einmal in PBS für 5 min. Inkubieren mit dem entsprechenden primären Antikörper in Blocking-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° verdünnt C. Waschen Fasern 3 mal in 5 min pro Waschgang in PBS, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Inkubieren mit dem entsprechenden sekundären Antikörper für 45 min bis 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie 3 mal in 5 min pro Waschgang in PBS. Gegenfärbung Kerne mit 1 mg / ml DAPI. Wenn Anfärben schwimmenden Fasern, jede Faser übertragen auf einen Glasobjektträger für Mikroskopie. Entfernen Sie überschüssiges PBS oder Medium. Bewerben Montage medium und fügen Sie dann das Deckglas. Fahren Sie mit Muskelfasern unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Siehe Abbildung 4 für repräsentative Immunfluoreszenz auf EDL Muskelfasern. Alternative Färbeverfahren Verwendung stärkerer Fixiermitteln in Verma, M. et al. 11 und Wosniak, AC et al. 12 beschrieben. Oligonukleotid oder Plasmid transienter Transfektion. Live Muskelfasern mit Plasmid-oder siRNA für spezifische Gen / s von Interesse transfiziert werden. Bei der Verwendung von siRNA, ist doppelt Transfektion für eine effiziente Gen-Knockdown empfohlen. Wir empfehlen die Durchführung der ersten Transfektion nach 8 Stunden aus der Isolation. Sechs Stunden nach der Transfektion mit frischem Medium ersetzt. Für siRNA-Transfektion, schlagen wir ausgehend unter Verwendung einer Endkonzentration von 50 nM. Genexpression knockdown kann durch RNA-Extraktion oder vorzugsweise durch Immunfärbung analysiert werden. Virusinfektion. Infektion von lebenden Muskelfasern ist möglich, obwohl die Inzidenz der ZelleTod ist höher als mit Oligo Transfektion und die Effizienz der Infektion kann variabel in Abhängigkeit von Muskelerkrankungen und Alter aufweisen. Zum Beispiel sind intakt erwachsenen Muskel Muskelfasern insbesondere nicht in Reaktion auf virale Infektion durch die Anwesenheit von die Basalmembran von dem gezeigt wurde, um eine Schutzbarriere gegen Infektion Host 13, 14 vorzusehen. Lentivirale Vektoren werden über retrovirale Vektoren bevorzugt, weil sie Ruhestrom (nicht mitotischen Zellen) infizieren können. Bei viralen Infektionen, ist es ratsam, Kultur Fasern auf einer Matrigel beschichteten Teller oder Platte und lass Muskelfasern Medienberichten Bedingungen für die ersten 24 Stunden einzustellen. Live-Imaging. Leben Bildgebung von Muskelfasern ist besonders zeitaufwendig und erfordert ein Mikroskop mit einem 37 ° C, 5% CO 2-Kammer ausgestattet. Es ist sinnvoll, bei der Beurteilung des Verhaltens der einzelnen Satelliten-Zellen. Arbeit mit dieser Technik wurde für die Entdeckung der Satelliten-Zell-Heterogenität instrumentalen und ihre beha studierenVior auf Fasern (15 und 16).