Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

1. Подготовка искусственного спинномозговой жидкости и внутриклеточного решение Перед началом эксперимента, нужно подготовить внутреннее решение для патч зажим записи, а также искусственные цереброспинальной жидкости (ACSF) в гиппокампе подготовки. Вы кроме того, необходимо рассечение комплект, состоящий из хирургических ножниц и тонкая диафрагма ножницы, две лопатки и щипцы (тонкие инструменты науки); устройство стекла газом (микро-фильтр свечи, РОБУ Германия) и ткань сетки (москитные сетки или нейлон плотный), а также суперклея (Uhu Dent). Конфигурация установки патча кусочек электрофизиологии была описана Финкель и Bookman, 2001 1. Для внутреннего решения, растворить (в мм): 105 K-глюконата, 30 KCl, 10 HEPES и 0,3 EGTA в деионизированной воде (в 70-80% от конечного объема). Охладите раствор до 4 ° C и добавить (в мм): 4 АТФ-Mg, 0,3 GTP-Tris и 10 фосфокреатина. Отрегулируйте рН до 7,4 с КОН и заливки ир деионизированной водой до конечного объема. (Osmolaritiy: ~ 280 мосм). Фильтр это решение (размер пор 0,2 мкм). Аликвоты раствор стабилен в течение 3-4 недель при – 20 ° C. За один день эксперимента, ~ 1 мл раствора внутренней необходимости. Если не указано иное, ACSF используется для приготовления гиппокампе и записи клеток в CA1 области, содержит (в мМ): 119 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 и 11 глюкоза. Растворите этих солей в деионизированной воде (~ 320 Осмолярность мосм) и кислородсодержащих это решение в течение 10 мин (рН ~ 7,3 – 7,4) с карбогена (95% O 2 и 5% CO 2). Подготовка по крайней мере, 1 л раствора на эксперимент. Особое внимание должны быть приняты для подготовки ткани гиппокампа, который будет использован для проведения экспериментов в CA3 регионе гиппокампа. Действительно, этот регион является склонным к эпилептиформной активности и последующее гибели нейронов. Таким образом synaptIC деятельность должна быть сильно уменьшено во время среза подготовки, и это достигается путем выполнения гиппокампа рассечение в ледяной раствор сахарозы, содержащий (в мм): 87 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 2 CaCl, MgCl 7 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 и 75 Глюкоза сахарозы. В этом решении, в сочетании с низким содержанием натрия, кальция низкой и высокой концентрацией магния массово снижать пресинаптических стрельбы и вероятность выпуска, а также постсинаптических NMDA активность рецепторов, таким образом минимизируя спонтанной активности и гибели клеток. После приготовления срезов гиппокампа используются для записи клеток из CA3 регионе перфузии изменения ACSF, содержащего 4 мМ CaCl 2 и 4, MgSO 4, чтобы свести к минимуму полисинаптических деятельности. 2. Острый гиппокампа Подготовка Slice Охладить ~ 300 мл ACSF для нарезки камеры, а также для подготовки при 4 ° С, при этом постоянно кислородом скарбогена. Подготовьте небольшой стакан с ACSF при комнатной температуре (RT) для хранения срез, который также кислородом с карбогена (схема Рисунок 1). Anesthetize мыши под капотом с небольшим бумажным полотенцем пропитанные 1 мл изофлурана, которая добавляется в клетку. После того, как мышь глубоко под наркозом, отрезать голову и добавить его прямо в небольшое блюдо с ледяной кислородом ACSF. Снимите кожу головы с небольшим ножницами и передать голову на ткани для последующих шагов. Начало препарировать гиппокамп, как показано и описано на рисунке 1. Вырезать 300-400 мкм поперечных срезов на низкой скорости (3 мкм / сек) и вибраций частотой 70 Гц в ледяной кислородом ACSF, и перенести их в камеру хранения. Пусть ломтиками остальное при комнатной температуре в течение по крайней мере за 1 час до записи. Ломтики для CA3 экспериментов хранятся 25 мин при 34 ° C и не менее 30 минут при комнатной температуре, чтобы оправиться от нарезки процесса. </OL> 3. Двойная запись вызванных астроглиального токи и потенциалы нейронов поля Мы здесь описано, как записать синаптически-вызванных астроглиального и нейронных ответов, т. е. ответов, индуцированная активация через синапс afference стимуляции с использованием внеклеточных электродов. Постоянно заливать записи камеры с кислородом ACSF (1.5-2 мл / мин, RT), содержащего 100 мкМ пикротоксина (ГАМК антагонист), чтобы изолировать возбуждающие ответы. Передача кусочек на поли-L-лизин (1,5 до 3 мг / мл) покрытием покровное, смочите жидкостью для достижения хорошей адгезии часть и добавить каплю ASCF в верхней части среза. Поместите покровное в записи камеры. Блокада тормозных передачи пикротоксина может привести к эпилептиформной активности, т. е. спонтанно, синхронное возбуждение нейронных популяций, которая будет искажать измерения вызванных событиями. Таким образом, для предотвращения эпилептиформной активности, сделатьплоский срез (только на поверхности) между CA1 и CA3 регионов, чтобы предотвратить распространение через Шаффер обеспечения (как показано на рисунке 2а). Stratum radiatum астроциты могут быть идентифицированы по их небольших размеров сома (~ 10 мкм) и звездчатые процесс сборки. Выберите ячейку по крайней мере, 20-30 мкм ниже среза поверхности. Установите стеклянный электрод стимуляции (макс. сопротивление ~ 1 МОм) на серебряной проволоки, подключенной к коробке изоляции стимул и заземлены на ванну (просто, обернув второй серебряной проволоки вокруг стеклянной пипетки). Поместите стимуляции электродов в область обеспечения Шаффер, как показано на рисунке 2А на расстоянии 200-300 мкм от выбранного астроцитов. Установите электрод поля записи (~ 2-5 МОм) на хлорированной серебряной проволоки подключены к headstage усилителя. Оба электрода заполнены до с ACSF. Выберите в multiclamp режиме I = 0, что отключает внешние комспрос вход и поместить электрод ~ 50 мкм от астроцитов в области radiatum слой (рис. 2A). Запишите ответы с Gain 2 до 10 и фильтр с 2 кГц фильтр Бесселя. Электрический ток инъекции в мозг срез вызывает потенциалы действия в окружающем Шаффер обеспечения аксонов и последующее освобождение передатчик на пресинаптических окончаниях, что проект постсинаптических CA1 пирамидальных нейронов. Выпустила передатчики вызовет положительный поток заряда в клетки через рецепторы постсинаптических ионотропных, который является измеримой внеклеточно в виде небольшой отрицательный потенциал. Это поле возбуждающих постсинаптических потенциалов (fEPSP) объединяет деятельность группы одновременно активных нейронов, в то время как тормозящий передачи их фармакологически. Нанесите несколько тестовых импульсов (0,1 мсек), чтобы вызвать fEPSP, некоторые репозиционирование стимуляции электродов может помочь увеличить fEPSP. Типичный CA1 слой излучающихит fEPSP показано на рисунке 2B. Более подробную информацию о позиционировании и ответов сигналы могут быть найдены в юанях и соавт. 2003 2. FEPSP амплитудой в здоровом гиппокампа ломтик обычно должны быть более чем в два раза больше амплитуды волокна залп. Для точной количественной оценки fEPSP амплитуды или склон, вызванных Réponse должны быть моносинаптических, как полисинаптических деятельности (обнаруживается как мульти-пик ответов) указывает синаптической активности зависит от электрической стимуляции, который может быть знаком для возбудимость. Для экспериментов, выполненных в СА3 области гиппокампа, стимуляции и записи пипетки позиционируется как показано на рисунке 3C. Чтобы четко определить мшистых входа волокна, которые сильно содействие, в паре-импульсной стимуляции (50 мс паузы интервал) и 1 Гц стимуляции в течение нескольких секунд применяется массово повышение исходно низкой амплитуды вызванных fEPSP responses.At концаэксперимента, DCGIV, антагонист mGluR2 / 3 рецепторов, можно мыть в дальнейшей убедиться, что действительно мшистых волокон входы были стимулированы. Применение этого антагониста должно уменьшить fEPSP на ~ 90% в связи с высокой экспрессией mGluR2 / 3 рецепторы, ингибирующие пресинаптического высвобождения из бутонов мшистых волокон. Заполните патч пипетки (~ 2-5 МОм) с фильтром внутреннего решения и закрепить его на хлорированной серебряной проволоки соединен со вторым headstage, применять положительное давление с помощью шприца, который подключен через трубку к вашей пипетки держателю. Постоянно применяется 20 мс тест импульса 10 мВ и переместите пипетку в ткани, пока не достигнете клеточной поверхности и отклонения в мембрана становится видимым. Обнулить пипетки смещения, удалите избыточное давление, и зажмите мембраны – 80 мВ. Подождите, пока gigaseal (по крайней мере 1 ГОм) достигается (она не должна занять больше времени, чем несколько секунд). Нежные применение некоторых отрицательное давление может помочь достичь AGigaseal. Перерыв в клетку достигается за счет коротких применения отрицательного давления или с помощью Зап функции в multiclamp. Начало одновременной регистрации залога Шаффер вызвали fEPSP и астроглиального ответ в напряжении зажим (Vhold – 80 мВ, частотой 0,1 Гц, фильтр Бесселя 2 кГц, коэффициент усиления 10). Астроглиального текущий ответ двухфазный: сначала вы увидите быстрый переходный внешним током, отражающие fEPSPs порожденных соседними пирамидальных клеток. Это сопровождается медленно поднимается и убывающих внутрь тока (сохраняющийся несколько секунд (> 10 сек) после прекращения нейронных ответов). Этот ток в основном за счет калия вступления в астроциты, после освобождения от окружающих деполяризованной постсинаптической терминалов. Одновременно активировать быстрые переходные транспортера глутамата тока (GLT), вызванный пресинаптического высвобождения глутамата маскируется калия тока. Проведение потенциал астроцитов, а также доступ к сопротивлению патча должно быть движениеnitored в течение всего эксперимента и не должна изменяться более чем на ~ 20%, чтобы избежать неточных мониторинга астроглиального Reponses в связи с изменениями условий съемки. Только астроциты с начальной потенциальной холдинг> -70 мВ должны быть исследованы для изучения здоровых клеток. Переход от напряжения тока Зажим для записи вызвала астроцитов деполяризации мембраны. Изолировать глиальных транспортеров глутамата (GLT) ток перфузии рецептора глутамата ионотропных блокатор кинуреновой кислоты (5 мМ), пока fEPSP полностью заблокирован и амплитуда GLT достигли плато. Чтобы четко определить GLT тока, применять специфический антагонист DL-трео-β-Benzyloxyaspartatic кислота (DL-TBOA, 200 мкМ). Увеличение стимуляции силы, 2-кратного до 5-кратного для записи нейронов и астроглиального ответных мер на различных синаптической силы и применяются два близко расположенных стимулов (50 мс интервал) для расследования ответы на парных импульсов стимуляции. Стабильность серии Resistance и мембранного потенциала глиальных клеток должны быть проверены всей записи. Чтобы представить себе масштабы разрыва соединения-опосредованной астроглиального сетей, красителей связи эксперименты должны быть выполнены в текущем режиме зажим, без инжекции тока, с тем чтобы пассивной диффузии низкомолекулярных красителей (<1,5 кДа), такие как сульфородамина-B, через каналы щелевых контактов. Чтобы свести к минимуму побочные красителя в окружающие ткани, положительное давление должно применяться через патч пипетки только при въезде в тканях и патч должен быть достигнут как можно скорее.