تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد
Summary
إعداد شرائح الدماغ الحادة من الحصين معزولة، فضلا عن التسجيلات في وقت واحد من الخلايا النجمية الكهربية والخلايا العصبية في<em> الطبقة المشععة</emيوصف> خلال التحفيز للضمانات SCHAFFER. ويتجلى عزلة الدوائية من البوتاسيوم astroglial والتيارات نقل الغلوتامات.
Abstract
الخلايا النجمية تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا العصبية الثلاثية، حيث أنها تدمج وتعدل نشاط الخلايا العصبية. في الواقع، بمعنى مدخلات الخلايا النجمية العصبية من خلال تفعيل قنواتها أيون والمستقبلات العصبية، ومعالجة المعلومات جزئيا من خلال الإفراج النشاط تعتمد على gliotransmitters. وعلاوة على ذلك، تشكل الخلايا النجمية نظام امتصاص الرئيسي لالغلوتامات، والمساهمة في التخزين المؤقت المكانية البوتاسيوم، وكذلك لإزالة GABA. هذه الخلايا ولذلك نراقب باستمرار النشاط متشابك، وبالتالي هي مؤشرات حساسة للتغيرات في الغلوتامات synaptically صدر، مستويات البوتاسيوم خارج الخلية وGABA. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إحداث تغييرات في نشاط امتصاص astroglial التخزين المؤقت أو القدرة لديهم تأثيرات شديدة على وظائف الخلايا العصبية، ويمكن التغاضي عندما تميز حالات physiopathological أو الفئران خروج المغلوب. تسجيل المزدوج للأنشطة الخلايا العصبية وبالتالي astroglial وسيلة هامة لدراسة التعديلات فيقوة متشابك يرتبط في الأذهان التغيرات في امتصاص astroglial والقدرات التخزين المؤقت. هنا نحن تصف كيفية إعداد شرائح قرن آمون، وكيفية تحديد الخلايا النجمية الطبقة المشععة، وكيفية تسجيل الاستجابات العصبية الكهربية في وقت واحد وastroglial. وعلاوة على ذلك، ونحن تصف كيفية عزل التيارات عقاقيري synaptically-أثار astroglial.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسجيل المزدوج للsynaptically التي يسببها استجابات الخلايا العصبية والدبقية هو وسيلة مفيدة لدراسة التعديلات عبر الإنترنت في أنشطة ما قبل وبعد المشبكي المرتبطة التغييرات في خصائص astroglial. وأثار-synaptically إزالة الاستقطاب الغشاء الدبقية هو مقياس مباشر من ارتفاع البوتاسيوم خارج الخلية 8، ويرجع ذلك جزئيا إلى العمل قبل المشبكي اطلاق المحتملة، ولكن في الغالب لإزالة الاستقطاب بعد المشبكي 7. ويمكن استخدام تسجيلات لذلك من المحتمل الدبقية ديناميات غشاء للتحقيق في استثارة التعديلات قبل المشبكي، والنشاط بعد المشبكي، خارج الخلية حجم مساحة التخزين المؤقت والقدرات البوتاسيوم 6 و 8. ونقل الغلوتامات astroglial الحالي هو مقياس الحساسة الإفراج الغلوتامات قبل المشبكي، قادرة على رصد التغيرات قصيرة الأجل في احتمال الإصدار 3 و 5 و 9. وعلاوة على ذلك يمكن أن تستخدم لتوصيف وظيفي المشبك الدبقية التفاعلات في نقاط الاشتباك العصبي مختلفة أو في الحادي والتنموية المختلفةالأعمار 10. وينبغي التأكيد على أن درجة الحرارة العالية هي GLTs 11 الحساسة ويقودها التدرج الكهروكيميائية من نا +، + K وH +12. وبالتالي السعة وحركية التيار GLT تعتمد إلى حد كبير على الظروف التجريبية المختارة. وعلاوة على ذلك، ومن المعروف أن دورة الوقت الفعلي لإزالة الغلوتامات astroglial المستمدة من GLT الحالي المسجل إلى أن تحجب جزئيا. هذا ويرجع ذلك إلى تصفية التيارات GLT عن عوامل مثل خصائص سريان التيار الكهربي من الخلايا النجمية أو الإفراج الارسال غير متزامن، التي تشوه حركية بهم 13. وقد تم تطوير أساليب استخراج ميزات الزمني للآليات الترشيح، ويمكن استخدامها لاشتقاق إزالة الغلوتامات الفعلية دوام في حالات فيزيولوجية أو مرضية، كما يؤديها recenly 6،13،14. بالإضافة إلى ذلك، في وقت واحد تسجيل من إزالة الاستقطاب الغشاء astroglial، في المشبك الحالية، يمكن أن توفر insigHTS في التعديلات المحتملة للالعابرين البوتاسيوم خارج الخلية. الخلايا النجمية واحد اتصل تصل إلى 100،000 نقاط الاشتباك العصبي من الخلايا العصبية 100 ~ مختلفة، وبالتالي لا تدمج وتعدل نشاط الشبكات العصبية المحلية.
عند استخدام هذه التقنية المقدمة هنا تسجيل أي الكهربية خلية كاملة من الردود الخلايا النجمية للحصول على أفكار في النشاط متشابك القاعدية، ينبغي للمرء أن نضع في الاعتبار أن الخلايا النجمية في التصحيح، المشبك، تسجيلات على المستوى سوما تسمح التيارات كشف مصدرها في الغالب من خلية سوما أو العمليات القريبة. في الواقع، والتيارات في الكشف عن سوما جزئيا فقط تنشأ من العمليات البعيدة غرامة عندما التنشيط قوية من المستقبلات والقنوات التي تحدث في عمليات متعددة غرامة يمكن أن تولد تيارات نشر إلى سوما الخلية. وبالتالي مستقبلات القاعدية والنشاط في القناة العمليات الفردية الصغيرة التي تغطي حجرات astroglial متشابك قابلا للاكتشاف على الإطلاق. هذا يرجع جزئيا إلى محدودية اليرقاتالاتحاد العالمي للتعليم والزمنية السيطرة على التيارات والفولتية الغشاء بواسطة التسجيلات التصحيح، المشبك خلية كاملة من الخلايا النجمية في الموقع. ومع ذلك، ينبغي الإشارة إلى أن سطح عمليات فيرة نجمي صغيرة يتجاوز إلى حد بعيد منطقة الغشاء من العمليات الرئيسية وسوما. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه microdomains perisynaptic astroglial تحتوي على مستقبلات ذات الصلة وظيفيا وقنوات، والتي تلعب دورا هاما المحتمل في الاتصالات وتنظيم دبقية متشابك. هذه التقنية قدمنا هنا بالتالي فهي مفيدة في الغالب لدراسة التكامل نجمي النشاط متزامن من الفرق العصبية، والتي تحدث بشكل خاص خلال التحفيز afference. لا ينبغي أن تستخدم لدراسة الحوار بين نقاط الاشتباك العصبي الفردية وعمليات المتاخمة نجمي غرامة تحدث خلال النشاط العفوي القاعدية. وطريقة بديلة لدراسة الردود astroglial المحلية الناجمة عن النشاط متشابك القاعدية تكون لأداء التسجيلات المشبك التصحيح من العمليات الدقيقة، ودواحد من كل التشعبات 15. على الرغم من أن هذه العمليات الترقيع غرامة astroglial تتحدى الأرجح بسبب صغر حجمها، وربما هو وسيلة لتحقيق لكشف الحوار أكثر حميمية بين microdomains astroglial ونقاط الاشتباك العصبي الفردية. ومع ذلك، قد الكهربية الصغيرة المرجح الردود astroglial الناتجة عن العمليات الفردية astroglial الغرامة أدناه كشف العتبة، منذ الضوضاء الكهربائية تصل في المتوسط سنويا 3-5 في التصحيح، المشبك التسجيلات. طريقة أخرى لدراسة الردود astroglial إلى النشاط متشابك هو التصوير الكالسيوم، منذ تفعيل مستقبلات غشاء نجمي أو نقل المواد من neuroactive يمكن أن تؤدي العابرين الكالسيوم داخل الخلايا. ومع ذلك، قد تحميل الجزء الأكبر من الخلايا النجمية مع مؤشرات الكالسيوم أيضا تعكس أساسا جسدية النشاط 16. الجمع بين التصوير الكهربية والكالسيوم يمكن أيضا الكشف عن إشارات الكالسيوم الصغيرة من عمليات astroglial غرامة، والتي تحدث إما تلقائيا أو أثار بذ التحفيز متشابك الحد الأدنى 17 و 18. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن مؤشرات الكالسيوم عالية تقارب قد تتصرف مثل مخازن الكالسيوم وتثبيط مسارات الكالسيوم المهم الإشارة، في حين تقارب المؤشرات المنخفضة قد عمل تحت مستوى الكشف. وأخيرا، تقنية أنيقة وغير الغازية لدراسة الأحداث الكالسيوم في عمليات نجمي الدقيقة، والتي تلتف أيضا من بين الخلايا جزيئات تبييض يشير خلال خلية كاملة التصحيح، المشبك، ويتألف جهاز استشعار في استخدام الغشاء الكالسيوم المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في الخلايا النجمية في الموقع، وكذلك في الجسم الحي 19. ومع ذلك، يمكن التصوير الكالسيوم توفر سوى معلومات حول جزيء إشارة واحدة، التي تشارك في العديد من الأنشطة ولكن ليس كل الخلوية، في حين خلية كاملة التصحيح، المشبك يوفر معلومات كمية عن جميع التيارات الأيونية مختلفة أدت إلى قناة وتفعيل مستقبلات. في وقت واحد ولذلك الكهربية التسجيلات من الخلايا العصبية والخلايا النجميةهي طريقة فريدة وقوية على الانترنت لكشف ديناميات إشارات الأيونية دبقية ومعلوماتها الدماغ تجهيز الدور.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر دانا Kamalidenova، Autexier مورغان، وChopier روش، الذي جعل الفيديو والرسوم المتحركة، وكذلك لبيك فلوريان الصور ومرحلة ما بعد الإنتاج من الفيديو الصوت عبر. وقد رعت هذا العمل من أوليمبوس وبدعم من المنح المقدمة من HFSPO (شهادة جائزة التنمية)، ANR (البرنامج ناطقون chercheurs وبرنامج علوم الأعصاب بلان)، FRC (الاتحاد بور LA RECHERCHE سور جنيه Cerveau)، ولوس انجليس INSERM سالبيتريير Salpêtrière المستشفى (الأبحاث المترجمة العقد) لNR، من وزارة البحوث الفرنسية ودويتشه زمالات ما بعد الدكتوراه لForschungsgemeinschaft UP، ومن "في حدود علوم الحياة" الدكتوراه المدرسة، باريس ديدرو جامعة بيتنكور شولر الأساس، وFRM (مؤسسة بحوث بور لا MEDICALE) زمالة الدكتوراه لJS
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | dissolve in DMSO |
| Kynurenic Acid | Tocris | 0223 | dissolve at 34 °C stirring or sonication |
| DL-TBOA | Tocris | 1223 | DCG IV Tocris 0975 |
References
- Finkel, A., Bookman, R., Crawley, J. N., et al. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. , (2001).
- Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
- Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
- Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
- Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
- Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
- Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
- Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
- Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
- Castro, M. A. D. i., et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).
