Esecuzione Lavage vaginale, di colorazione viola di cristallo, e la valutazione citologica vaginale per l'identificazione ciclo estrale Staging mouse

1. Reagenti Preparazione Per sterile lavanda vaginale, autoclave acqua bidistillata (DDH 2 O) e conservare in un contenitore ermeticamente chiuso a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Per la valutazione citologica, aggiungere 0,1 g di polvere cristalvioletto a 100 ml di DDH 2 O. Mescolare bene. Cristalvioletto macchia (0,1%) può essere conservato in un contenitore ermeticamente sigillato a temperatura ambiente fino a quando necessario. 2. Raccolta di cellule vaginali (Lavage vaginale) Posizionare una lampadina lattice sulla fine di una sterile 200 microlitri punta e di elaborare circa 100 ml di sterile DDH 2 O utilizzando le gradazioni sulla punta come linea guida del volume. Sollevare il mouse fuori dalla sua gabbia e metterla sulla tramoggia gabbia (coperchio) con la sua estremità posteriore / posteriore verso di voi. Afferrare saldamente la coda e sollevare la parte posteriore. Il mouse avrà ora solo le zampe anteriori afferrare la tramoggia. A questo punto il mouse può urinare. Se è così, Attendere fino a quando si ferma minzione. In caso di urina a sinistra all'ingresso del canale vaginale, si consiglia di sciacquare l'apertura con eccesso di DDH 2 O con una punta separato (cioè, non la punta del prelievo del campione). Posizionare l'estremità del 2 DDH O pieno di punta all'apertura del canale vaginale, avendo cura di non penetrare l'orifizio vaginale come (e cervicale), la stimolazione può indurre pseudogravidanza nei ratti 1,2. Rapporti recenti suggeriscono i topi sono meno sensibili a questo effetto comunque si dovrebbe aver cura di ridurre al minimo il grado di invasività in analisi ripetute 3. Delicatamente premere lo stantuffo per espellere un quarto alla metà del volume di acqua (~ 25-50 microlitri) in apertura del canale vaginale. Il liquido spontaneamente aspirare nel canale di inserimento senza punta. Rilasciare lentamente la pressione esercitata sul bulbo. Il fluido si ritirerà nuovamente dentro la punta. Evitare pressione rilasciando troppo velocemente per evitare l'aspirazione di liquidonel bulbo. Una punta filtrata può essere utile a questo scopo. Ripetere i tempi delle fasi precedenti 4-5 usando la punta stessa, bulbo, e fluido per ottenere un numero sufficiente di cellule in un singolo campione. Posizionare il fluido sul vetrino, e consentire l'striscio asciugare completamente a temperatura ambiente. Una volta asciutto, questi strisci estro può essere colorato immediatamente o conservate e colorate in un secondo momento. 3. Colorazione citologica utilizzando Crystal Violet * 4 Posizionare il vetrino a secco in una vaschetta Coplin (o da altro vaso colorazione simile) contenente il cristalvioletto colorare per 1 min. Rimuovi per un barattolo secondo Coplin contenente DDH 2 O. Lavare il vetrino con DDH 2 O per 1 min. Ripeti. Rimuovere l'eccesso DDH 2 O dai bordi del vetrino con leggeri tergicristallo tessuto, evitando il contatto con lo striscio colorato. Pipettare circa 15 ml di glicerolo in cima al coperchio e striscioscivolare. In alternativa, altri reagenti istologici di montaggio può essere utilizzata per ottenere un più permanente, non-diffondente macchia. * Il metodo di colorazione qui descritto è il più semplice procedura che può essere eseguita in qualsiasi laboratorio. Altri metodi in grado di fornire ulteriori dettagli. Ad esempio, utilizzando la colorazione Papanicolaou, la maturità di nucleate cellule epiteliali possono essere distinti con le cellule meno mature le cellule colorate con turchese e più maturi rosa o arancione-macchiati. Queste differenze possono essere utilizzati per organizzare proestrus presto o tardi. 4 4. Citologia Vaginale Esaminare lo striscio al microscopio ottico per determinare i tipi di cellule presenti. Esame microscopico dovrebbe essere fatto immediatamente dopo colorazione come cristalvioletto diffonderà dalle cellule nel tempo quando si utilizza glicerolo per coprioggetto. Microfotografie deve essere assunto al momento di analisi per documentare citologia. Iniziamo ad esaminare la entirstriscio e con un ingrandimento inferiore. Selezionare un'area rappresentativa e passare a un ingrandimento maggiore. Vedrete cornified squamose cellule epiteliali, leucociti, e / o nucleate cellule epiteliali (risultati rappresentativi, Figura 1A-C). Il rapporto tra presente cellule vi permetterà di determinare la fase estrale del mouse al momento del prelievo del campione (risultati rappresentativi, figura 1D-G) e il suo stato ormonale immediata (discussione, Figura 2). 5. Risultati rappresentativi Citologia: Tre tipi cellulari primarie può essere rilevato in campioni di striscio vaginale: (1) nucleate cellule epiteliali (Figura 1A), (2) cornified cellule epiteliali squamose (Figura 1B), e (3) leucociti (Figura 1C). Nucleate cellule epiteliali hanno un citoplasma poco sporca, più scuro macchiato membrana plasmatica, e un nucleo ovale ( <strong> Figura 1A). Cornified cellule epiteliali squamose sono uniformemente macchiato, più poligonale loro predecessori nucleate epiteliali, e mancanza di un nucleo (Figura 1B). Leucociti polimorfonucleati può essere distinto da cellule epiteliali dalla loro forma irregolare, scuro macchiato nuclei polimorfi, e le piccole dimensioni (Figura 1C, frecce nere). Contaminazione dovrebbe essere presente nelle urine striscio, cristalli di acido urico sono prontamente rilevato dalle loro strutture cristalline dissimili a qualsiasi tipo di cella attesi (Figura 3). In questo caso, e la rilevazione oscura di tipo cellulare predominante, lo striscio deve essere eliminato e non utilizzati a scopo di stadiazione. Staging: Il rapporto relativo di tipi di cellule osservate negli strisci può essere utilizzato per identificare la fase del ciclo estrale del mouse, il giorno della raccolta del campione (Figura 1D-G). Durante proestro, le cellule sono quasi esclusivamentegruppi di rotondo, ben formato nucleate cellule epiteliali (Figura 1D, cellula rappresentante indicato dalla freccia bianca). Durante l'estro, le cellule sono prevalentemente cornified cellule epiteliali squamose, presenti in gruppi densamente (Figura 1E, cellula rappresentante indicato dalla freccia). Durante metestrus, piccoli leucociti scuro macchiato predominano (Figura 1F, cella rappresentante indicato dalla freccia nera). Corneo cellule epiteliali squamose possono essere osservati, spesso in frammenti, (Figura 1F, cellula rappresentante indicato dalla freccia nera). Durante il diestro, cornified rare cellule epiteliali squamose possono essere ancora presenti (Figura 1G, cella rappresentante indicato dalla freccia nera), ma ancora predominano leucociti (Figura 1G, cella rappresentante indicato dalla freccia nera). Metestrus può essere distinto da diestro dalla comparsa di cellule nucleate epiteliali in diestro ( <stron g> Figura 1G, cellula rappresentante indicato dalla freccia bianca). Figura 1. Valutazione citologica di strisci vaginali può essere utilizzato per identificare fase estrale tre tipi principali di cellule vengono rilevati in campioni di striscio vaginale:. (A) nucleate cellule epiteliali, (B) cornified cellule epiteliali squamose, e (C) leucociti. Il rapporto di questi tipi di cellule presenti nel striscio può essere utilizzato per identificare in topi (D) proestrus, (E) estro, (F) metestrus, o (G) come descritto in diestro risultati rappresentativi. Punte di freccia nere in E, F e del punto G alla rappresentanza cornified cellule epiteliali squamose. Frecce nere in C, F e del punto G alla leykocytes rappresentativi. Frecce bianche in D e rappresentante evidenziare G nucleate cellule epiteliali. . "Alt =" jpg Figura 2 "/> Figura 2. Citologia striscio vaginale riflette eventi endocrini sottostanti. Dettagli sono forniti anche in discussione. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 3. Cristalli di acido urico possono essere presenti di colorazione viola cristallo di urina-campioni contaminati. (A) I cristalli sono trasparenti e possono essere di varie dimensioni (frecce e regione scatola ingrandite in (B)). Nessun cellule sono presenti in questo campo. Dovrebbe contaminazione cristallo acido urico entro campi usati per la colorazione citologica essere presente, può essere difficile identificare con precisione tipi di cellule presenti e lo striscio deve essere scartato. Barre di scala = 50 micron.