두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

1. ECM 코팅 문화 요리 나 Coverslips의 작성 PBS의 EC​​M 기판 (Dulbecco의 식염, Invitrogen, # 14040-133를 인산 버퍼)를 용해하여 ECM 주식 솔루션을 준비합니다. -80에서 0.2 mm 주사기 필터 (VWR, # 28145-495)와 aliquots에서 동결 ° C.를 사용하여 필터 PBS에서 원하는 농도에 ECM 주식 솔루션을 희석. MaxGel를 들어, DMEM (Dulbecco의 수정 된 이글 매체, Invitrogen, # 11995-065)에 희석. immunofluorescence을 수행 할 경우, 에탄올에 찍어으로 12mm 원형 유리 coverslips (VWR, # 89015-724)을 소독하고 건조 공기 수 있습니다. 이것은 무균 층류 후드에서 수행해야합니다. immunofluorescence을 수행 할 수하지 않을 경우 1.5 단계로 건너 뜁니다. 장소 (코닝, # 3526) 24 잘 플레이트의 각 우물에 coverslips을 소독. 3 시간 동안 실온에서 24 잘 플레이트와 배양의 각도에 희석 기판 솔루션의 0.5 ML를 추가합니다. ECM 솔루션을 기음과 thre을 씻어PBS에 전자 시간. PBS를 대기음 즉시 사용하거나 parafilm에 싸여과 4에서 ° C 최대 2 주까지 보관. 2. 해부 도구의 작성 추가 숯불로 Sylgard 판은 제조의 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다. 이 접시의 강한 검은 색 배경은 배아를 달아과 색상이 반투명 배아를 시각화 용이 들과는 좋은 대조를 제공에 대한 지원을 제공합니다. 접시를 준비하려면 균형 150g 부품 액체 15g 파트 B와 1g의 숯 가루 (세계 정밀 계측기, # SYLG184)에 트라이 – 부어 비커에 직접 무게. 나무 아이스크림 스틱이나 혀 억압자를 사용하여 함께 섞는다. 유리 또는 플라스틱 100cm 요리에 넣어. 모든 거품을 구울 수있는 요리 위 10~12인치에 대해 개최 소형 부탄 토치를 사용하십시오. 장소 접시에 뚜껑과 그냥 놔 설정하기 최소 24 시간에 앉아. (0.1 mm의 diamete Minutien 핀 삽입 분해 도구를 준비하려면R) 핀 홀더 (정밀 과학 도구, # 26002-10와 # 26018-17, 각각) 또는 26 게이지 바늘 (BD, # 309597) 포셉의 도움을 직각으로 구부러로는 악기를 해부로 사용할 수 있습니다. 가는 돌 (정밀 과학 도구, # 29008-22)를 사용하여 날카롭게 학생 뒤몽 # 5 포셉 (정밀 과학 도구, # 91150-20). 사용하기 전에 70 %의 에탄올과 함께 모든 해부 도구를 살균. 3. 태아의 수집 동물 사용위원회 규정에 따라 8.5 일 게시물 coitum에서 시간이 초과 임신 마우스를 안락사시켜야하고 자궁을 제거합니다. 멸균 PBS와 플라스틱 배양 접시에있는 장소 자궁. 멸균 PBS로 한 번 자궁을 씻는다. 해부 현미경 아래에서 조심스럽게 포셉 한 쌍의를 사용하여 deciduas에서 배아를 제거합니다. extraembryonic 세포막을 제거하고 필요한 경우 genotyping에 저장합니다. somites를 계산하여 스테이지의 배아. 이상적인 단계 explants는 세포 beh을 분석 할 수 있도록하는신경 배 상승하는 동안 av​​ior는 각각의 주름 막 상승하기 시작하여 두개골 mesenchyme의 주요 morphogenesis이 일어나기 전에 6 및 10 체절 단계 사이 여야합니다. PBS에서 배아를 씻으십시오. 더 페놀 레드 (Invitrogen, # 21063-029)을 포함하지 DMEM과 검은 색 sylgard 접시에 장소. extraembryonic 멤브레인을 제거하고 필요한 경우 genotyping에 저장합니다. 4. Explants의 작성 태아의 머리 지역에 걸쳐 가장 높은 배율의 현미경 촛점을 다시 맞춰. 각 손에 분해 바늘로 상처를합니다. 상처를 만들기 위해 장소에서 조직 및 기타를 개최 한 바늘을 사용합니다. rhombomeres에 앞 배의 머리를 잘라. 2 개의 같은 절반으로 머리를 두 갈래로 갈라지다하는 중간 선을 따라 자른다. 머리와 중간 선의 외부 가장자리 주위에 자른다. 이러한 상처는 외부 국경에서 premigratory 문양과 표면 외배엽을 제거하고합니다중간 선에서 prechordal 판. 나머지 조직은 explant되며 마이그레이션 두개골 신경 문장, paraxial 중배엽 및 표면 외배엽이 포함됩니다. 조직이 절단되면서 살균 파스퇴르 피펫을 사용하여 요리를 분석하던 쓰레기를 제거합니다. 이 해부하는 파편으로 explant를 혼란 방지 할 수 있습니다. 부드럽게 20 μl 피펫 팁과 pipetman와 등을 아래로 pipeting하여 explant을 씻는다. 이 느슨하게 연결된 세포를 제거하고 explants의 계단 가장자리를 방지 할 수 있습니다. 조심스럽게 20 μl 피펫 팁과 pipetman 잘 코팅 된 문화의 중심으로 자리를 사용하여 액체의 약 10 μl 각 explant를 선택합니다. explant를 커버 15 % FBS와 보충 문화 미디어 20 μl를 추가합니다. 1-2 시간의 humidified 조직 문화 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ° C)에서 개최 판은 explant은 접시의 바닥에 부착 할 수 있습니다. explant이 건조하지 않도록 주기적으로보기아웃. explant가 첨부되면, 조심스럽게 ° C waterbath에서 37 예열 된 10% FBS와 보충 각도 250 μl DMEM에 추가 할 수 있습니다. 일단 explants 판은 부드럽게 현미경 떨면서 때 이동하지 않습니다 첨부했습니다. 조직 문화 인큐베이터로 요리를 반환합니다. 24 시간 후, explants가 단단히 부착되고 세포가 이주가 시작됩니다. 현재 약리 대리인은 미디어에 추가 할 수 있습니다. 48 시간 도금 후, 세포는 explants에서 마이그레이션해야합니다. 마이그레이션 거리 시각화 및 이미징 할 수 있습니다. explants이 더 incubations과 감소 생존의 흔적을 보여 시작부터 우리는 일반적으로이 시점에서 문화를 중지합니다. 이러한 acridine 오렌지 나 trypan 파랑 등의 얼룩 중요한 또한 explant의 생존을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시점에서 이미지는 explant에서 마이그레이션 셀의 거리와 번호를 문서화하는 취득 할 수 있습니다. 또는, 만약 explants는 coverslips에 도금 된그들은 고정 및 immunohistochemical 분석은 관심 단백질을 시각화하기 위해 수행 할 수 있습니다. 프로토콜의 중요 단계 거의 같은 크기의 explants를 자른다. 원하는 explanted 조직과 혼란 파편을 피하기 위해 해부대로 해부 접시에서 모든 분해 파편을 해제합니다. 우물이나 coverslips에 도금 explants 잘의 중심에 explant과 미디어의 비말을 배치해야합니다. 미디어와 우물을 홍수 전에 첨부 할 수있는 충분한 시간을 explant 수 있습니다. 치료 조건은 사용하는 모든 테스트 기판 및 약리 에이전트에 대한 표준화해야합니다. 두 explants은 (왼쪽에서 하나 신경 튜브의 오른쪽에서 하나) 각 배아에서 만들 수 있습니다. 다른 실험 조건에서 돌연변이 마우스 라인에서 세포의 이주를 테스트를 할 때, 치료를 그룹에 포함 된 하나 돌연변이 제어 그룹의 explant과 다른 놔. 문제 해결 explants 첨부하지 않는 경우, 첨부 파일 할당 된 시간을 향상시킬 수 있습니다. 우리의 경험에서 explants의 약 절반은 첨부하지 않고 큰 explants 더 효율적으로 준수합니다. explants는 우물의 주변에 부착하면 그 이미지 어려울 것입니다. 우물의 중심에 explants를 배치해야합니다. 이상적으로 explants 약 같은 크기가 될 것입니다. 그러나, explant 크기 차이가 explants 세포 마이그레이션을 quanitating 때 보정 계수로 explants의 직경을 사용하기 위해 수정 될 수 있습니다. 오염이 발생하면 살균 된 연구 조건이 사용중인하십시오. 모든 도구와 작업 표면은 70 % 에탄올로 소독해야합니다. Pipets와 페트리 요리 새로운 살균해야합니다. explants은 절개 중에 손실 발생하면 주기적으로 explant을 잃지 방지하기 위해 쓰레기를 제거합니다. 마스터 해부 시간이 소요됩니다 연습이 걸립니다. Opti말 배율, 날카로운 해부 도구와 바늘 도움말.