Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

1. Voorbereiding van ECM Coated Cultuur gerechten of Dekglaasjes Bereid ECM stock oplossing door oplossen ECM substraat in PBS (Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, Invitrogen, # 14040-133). Filtreer een 0,2 mm spuitfilter (VWR, # 28145-495) en vries in aliquots bij -80 ° C. Verdun ECM stock oplossing in PBS gewenste concentratie. Voor MaxGel verdunnen in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065). Als immunofluorescentie zal worden uitgevoerd, steriliseren 12 mm ronde dekglaasjes (VWR, # +89,015-724) door dompelen in ethanol en laat aan de lucht drogen. Dit dient te gebeuren in de steriele laminaire kap. Als immunofluorescentie wordt niet uitgevoerd doorgaan naar 1,5 stap. Plaats gesteriliseerd dekglaasjes in elk putje van een plaat met 24 putjes (Corning, # 3526). Voeg 0,5 ml van het verdunde substraatoplossing aan elke well van 24 wells-plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Zuig uit de ECM-oplossing en was three keer in PBS. Aspireren uit PBS en gebruik onmiddellijk of verpakt in parafilm en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. 2. Voorbereiding van Dissectiemateriaal Sylgard platen met toegevoegde houtskool worden bereid volgens het protocol van de fabrikant. De resistente zwarte achtergrond van deze platen biedt ondersteuning voor beetgepakt het embryo en de kleur biedt een goed contrast dat vergemakkelijkt het visualiseren van de doorschijnende embryo. Om platen te bereiden wegen direct in een tri-giet bekerglas op een evenwicht 150 g, deel A, vloeibare 15 g deel B en 1 g houtskool poeder (World precisie-instrumenten, # SYLG184). Meng met behulp van een houten ijslolly stok of tongspatel. Giet in glazen of plastic 100 cm gerechten. Gebruik een kleine butaan fakkel gehouden ongeveer 10 tot 12 centimeter boven de gerechten te branden uit alle bubbels. Plaats deksels op platen en laat zitten voor ten minste 24 uur in te stellen. Om dissectie-instrumenten voor te bereiden insert een Minutien pin (0,1 mm diameter) in een penhouder (schone wetenschappelijke instrumenten, # 26002-10 en # 26018-17, respectievelijk) alternatief 26 gauge naalden (BD, # 309597) rechthoekig omgebogen met behulp van forceps kan worden gebruikt als ontleden instrumenten. Geslepen Student Dumont # 5 tang (Fine Science Tools, # 91150 tot 20) met behulp van een slijpsteen (Fine Wetenschappelijke Gereedschappen, # 29,008-22). Steriliseer alle dissectie-instrumenten met 70% ethanol voor gebruik. 3. Winnen van embryo Euthanaseren de getimede zwangere muis op 8,5 dagen na coitum volgens het gebruik van dieren commissie regelgeving en verwijderen baarmoeder. Plaats baarmoeder in een plastic petrischaal met steriele PBS. Ze wast baarmoeder met steriele PBS. Onder een dissectie microscoop verwijder embryo van deciduas met behulp van een pincet. Verwijder extra-embryonale membranen en sparen voor genotypering indien nodig. Stage embryo door het tellen van somieten. De ideale stappen om explantaten voor cellulaire analyse behAvior tijdens neurale voudige verhoging zou zijn tussen de 6 en 10 somiet stadia, wanneer de neurale plooien net beginnen te verheffen en voor de grote morfogenese van de craniale mesenchym plaatsvindt. Was embryo in PBS. Leg ze in een zwarte Sylgard plaat met DMEM dat er geen fenol rood (Invitrogen, # 21.063-029) bevat. Verwijder de extra-embryonale membranen en sparen voor genotypering indien nodig. 4. Bereiding van explantaten Heroriëntatie de microscoop bij de maximale vergroting over het hoofd gebied van de embryo. Maak sneden met een dissectie naald in elke hand. Gebruik een naald om het weefsel op zijn plaats en de andere ingedrukt om bezuinigingen te maken. Snijd de kop van het embryo anterior aan de rhombomeres. Knip langs de middellijn aan het hoofd halveren in twee gelijke helften. Snijd rond de buitenste rand van het hoofd en middellijn. Deze besparingen zullen verwijderen van de premigratory kuif en de oppervlakte ectoderm aan de buitengrens ende prechordale plaat op de middellijn. De resterende weefsel het explantaat en zal de migratie craniale neurale paraxiale mesoderm en ectoderm oppervlak bevatten. Omdat het weefsel wordt gesneden, verwijder ontleed puin van de schaal met behulp van een steriele pasteur pipet. Dit voorkomt verwarring het explantaat met puin ontleed. Voorzichtig wassen de explantatie door pipetteren op en neer met een 20 ul pipet tip en Pipetman. Hiermee verwijdert u losjes bevestigde cellen en het voorkomen van scherpe randen op de explantaten. Zorgvuldig halen elk explantaat in ongeveer 10 ui vloeistof met een 20 pi pipetpunt en Pipetman en in het middelpunt van de beklede kweekputje. Voeg 20 ul kweekmedium aangevuld met 15% FBS om de explant dekken. Plaat in een bevochtigde weefselkweek incubator (5% CO2, 37 ° C) gedurende 1-2 uur om het explantaat te hechten aan de bodem van de schaal. Zie regelmatig dat de explant niet uitdroogtuit. Wanneer het explantaat is bevestigd, Voeg aan elk putje 250 ui DMEM aangevuld met 10% FBS dat is verwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Zodra explantaten hebben bevestigd dat ze niet bewegen wanneer plaat wordt voorzichtig geschud onder de microscoop. Terug schotel naar weefselkweek incubator. Na 24 uur wordt de explantaten stevig zijn bevestigd en cellen begint te emigreren. Momenteel farmacologische middelen kunnen worden toegevoegd aan de media. 48 uur na het plateren zullen cellen gemigreerd van de explantaten. Gemigreerd De afstand kan worden gevisualiseerd en afgebeeld. We normaal gesproken niet meer de cultuur op dit punt sinds explantaten beginnen te tekenen van verminderde levensvatbaarheid met een langere incubaties tonen. Een vitale kleurstof zoals acridine oranje of trypan blue kan ook worden gebruikt om de levensvatbaarheid van het explantaat controleren. Op dit punt beelden kunnen worden verkregen om de afstand en aantal cellen die migreren uit de explantaat documenteren. Als alternatief werden als explantaten uitgeplaat op dekglaasjes,ze kunnen worden vastgesteld en immunohistochemische analyses uitgevoerd om eiwitten van belang te visualiseren. Kritische stappen in het protocol Snij explantaten van ongeveer dezelfde grootte. Wis alle dissectie puin van de dissectie plaat als u ontleden tot verwarrende puin te vermijden met de gewenste geëxplanteerd weefsel. Wanneer plating explantaten in putten of op dekglaasjes moet u druppel media plaatsen bij explantatie in het centrum van goed. Laat explanteren voldoende tijd te bevestigen voordat overstromingen het goed met media. Behandeling voorwaarden moeten worden gestandaardiseerd voor elke test substraat en farmacologisch middel gebruikt. Twee explantaten kan van elk embryo (van links en van rechts van de neurale buis). Bij het testen migratie van cellen uit mutantmuis lijnen onder verschillende experimentele condities, zet een mutant explant in de controlegroep en de andere in de behandelde groep. Problemen oplossen Als explantaten niet bevestigen, verhoging van de toegestane tijd voor de bevestiging. In onze ervaring, denk ongeveer de helft van de explantaten niet bevestigen en grotere explantaten zich efficiënter. Als explantaten hechten aan de omtrek van de put zullen zij moeilijk beeld. Zorg ervoor dat explantaten plaatsen in het midden van de put. Idealiter explantaten zal ongeveer van dezelfde grootte zijn. Desalniettemin kunnen afwijkingen in explant maat worden gecorrigeerd met de diameter van de explantaten als correctiefactor bij quanitating migratie van cellen uit explantaten. Mocht contaminatie optreden zeker steriele werkomstandigheden worden gebruikt. Alle gereedschappen en werkoppervlakken moeten worden gesteriliseerd met 70% ethanol. Pipetten en petrischaaltjes moeten nieuw zijn en steriel. Als explantaten krijgen verloren tijdens de dissectie, periodiek verwijderen van afval tegen het verlies van explantatie. Het beheersen van de dissectie is tijdrovend en vergt oefening. Optimal vergroting, scherpe dissectie-instrumenten en naalden hulp.