Een bepaling voor de permeabiliteit van de zebravis embryonale neuroepitheel
Summary
We beschrijven een levende hele dier kwantitatieve meting voor de permeabiliteit van de embryonale zebravis hersenen. De techniek analyseert het vermogen om cerebrospinale vloeistof en moleculen met verschillende molecuulgewichten te behouden in de neurale buis lumen en meten hun beweging van de ventrikels. Deze methode is nuttig voor het bepalen van verschillen in epitheliale permeabiliteit en rijping tijdens ontwikkeling en ziekte.
Abstract
De hersenen ventriculaire systeem geconserveerd is tussen gewervelde en bestaat uit een reeks onderling verbonden holten genaamd hersenventrikels, die bij het vroegste stadium van de ontwikkeling van de hersenen en worden gedurende het leven van het dier. De hersenen ventriculaire systeem wordt gevonden in vertebraten en de ventrikels ontwikkelen na neurale vaatvorming Wanneer de centrale lumen gevuld met cerebrospinale vloeistof (CSF) 1,2. CSF is een eiwitrijke vloeistof die essentieel is voor normale ontwikkeling van de hersenen en functie 3-6.
In zebravis, hersenventrikel inflatie begint circa 18 uur na de bevruchting (HPF) na de neurale buis is gesloten. Meerdere processen worden geassocieerd met hersenventrikel vorming, met inbegrip van de vorming van een neuro-epitheel, tight junction formatie die permeabiliteit en CSF productie reguleert. We toonden aan dat het Na, K-ATPase vereist voor hersenventrikel inflatie invloed al deze werkwijzees 7,8, terwijl claudin 5a is noodzakelijk voor tight junction vorming 9. Bovendien toonden we aan dat "relaxatie" van de embryonale neuro-epitheel, via remming van myosine, wordt geassocieerd met hersenventrikel inflatie.
Om de regeling van de permeabiliteit tijdens zebravis hersenventrikel inflatie te onderzoeken, ontwikkelden we een ventriculaire kleurstof retentie-test. Deze methode gebruikt hersenventrikel injectie in een levende zebravis embryo, een techniek eerder ontwikkeld in ons laboratorium 10 om fluorescerend label de cerebrospinale vloeistof. Embryo's worden vervolgens afgebeeld in de tijd als de fluorescente kleurstof zich door de hersenen ventrikels en neuro-epitheel. De afstand voor de kleurstof zich van de basale (niet-luminale) van de neuroepitheel tijd wordt gekwantificeerd en is een maat neuroepitheliale permeabiliteit (figuur 1). Wij merken op dat kleurstoffen 70 kDa en kleinere zal bewegen door de neuro-epitheel en kan detected buiten de embryonale zebravis hersenen op 24 hpf (figuur 2).
Deze kleurstof retentie assay kan worden gebruikt om neuro permeabiliteit analyseren in een verschillende genetische achtergronden, op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling en na milieu verstoringen. Het kan ook nuttig zijn in de behandeling van pathologische accumulatie van CSF. Over het geheel genomen deze techniek kunnen onderzoekers de rol en regulering van permeabiliteit te analyseren tijdens de ontwikkeling en ziekte.
Protocol
Discussion
We tonen dat zij permeabiliteit van de levende embryonale zebravis hersenen kwantificeren bepaald voor een kleurstof geïnjecteerd van een bepaald molecuulgewicht. Onze observatie dat de embryonale zebravis neuroepitheel is differentieel doorlaatbaar voor kleurstoffen van verschillende moleculaire gewichten suggereert dat de kleurstof beweegt via paracellulaire permeabiliteit. We kunnen echter niet uitsluiten dat de mogelijkheid van een transcellulaire bijdrage aan de waargenomen permeabiliteit. Deze techniek kan worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Geestelijke Gezondheid en National Science Foundation. Speciale dank aan Sive lab leden voor vele nuttige discussies en opbouwende kritiek, en Olivier Paugois voor deskundige vis veeteelt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
