Zebrafish 배아 Neuroepithelium의 투과율에 대한 분석
Summary
우리는 배아 zebrafish의 뇌의 투자율의 라이브 전체 동물 양적 측정을 설명합니다. 기술은 신경 튜브 내강 내에서 서로 다른 분자 무게의 중추 신경계와 분자를 보유 할 수있는 능력을 분석하고 심실의 움직임을 단정 지을. 이 방법은 개발과 질병 중 상피 투자율과 성숙의 차이를 결정하는 데 유용합니다.
Abstract
뇌 심실 시스템은 vertebrates 사이에 보존되어 있으며 뇌 개발의 초기 단계에서 형성과 동물의 삶을 통해 유지 뇌 심실라는 상호 충치의 일련의로 구성되어 있습니다. 뇌 심실 시스템은 vertebrates에서 발견하고, 심실은 중앙 루멘은 뇌척수 (CSF) 1,2로 채워 때, 신경 튜브 형성 한 후 개발을하고 있습니다. CSF는 정상적인 두뇌 개발과 기능 3-6을 위해 필수적이며 단백질 풍부한 액체이다.
신경 튜브가 폐쇄 된 후 zebrafish에서 뇌 심실 인플레이션은 약 18 시간 게시물 수정을 (hpf)에서 시작됩니다. 여러 프로세스가 neuroepithelium 형성, 투자율 및 CSF의 생산을 조절 긴밀한 접합 형성 등의 뇌 뇌실 형성와 연결되어 있습니다. 우리는이 모든 과정에 영향을 미치는, 오세영가 K-ATPase는 뇌 심실 인플레이션 필요하다고 보여claudin의 5A 꼭 접합부 형성 9 필요한 반면 에스 7,8. 또한, 우리는 마이 오신의 억제를 통해 배아 neuroepithelium의 "휴식"을 보여 뇌 심실 인플레이션과 연결되어 있습니다.
zebrafish의 뇌 심실 인플레이션 동안 투자율의 규정을 조사하기 위해, 우리는 심실 염료 유지 분석을 개발했습니다. 이 방법은 휘황 중추 신경계에 라벨을, 거실 zebrafish의 배아, 이전에 우리 연구소 10 개발 기술에 뇌 뇌실 주입을 사용합니다. 태아는 다음 뇌 심실과 neuroepithelium을 통해 형광 염료 이동으로 시간이 지남에 따라 이미징 있습니다. 거리 염료 전면 정량 멀리 시간이 지남에 따라 neuroepithelium의 기초 (비 luminal) 측에서 이동하고 neuroepithelial 투자율의 측정 (그림 1)입니다. 우리는 염료 70 kDa과 작은이 neuroepithelium을 통해 이동한다는 관찰하고 detecte 할 수 있습니다24 hpf (그림 2)에서 배아 zebrafish의 뇌 이외의 D.
이 염료 유지 분석은 개발 기간 동안 다른 시간에 서로 다른 유전 배경을 다양한 neuroepithelial 투자율을 분석하는 데 사용, 환경 섭동 후 할 수 있습니다. 또한 CSF의 병적 인 축적을 조사에 유용 할 수 있습니다. 전반적으로,이 기법은 수사관 개발과 질병 중 투자율의 역할과 규정을 분석 할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
우리는 주어진 분자 무게의 주입 염료에 대한 결정으로 생활 배아 zebrafish의 뇌의 투자율을 수량화 할 수있는 능력을 보여줍니다. 배아 zebrafish의 neuroepithelium는 분자 가중치를 서로 다른의 염료에 differentially 투과성있는 것으로 관찰 염료가 paracellular 투자율을 통해 이동하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리는 관찰 투자율에 transcellular 공헌의 가능성을 배제 할 수 없습니다. 이 기술은 튜브의 내부와 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 정신 건강 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원되었습니다. 전문가 생선 축산에 대한 많은 유용한 토론과 건설적인 비판, 그리고 올리버 Paugois에 대한 Sive 연구소 회원에게 특별 감사드립니다.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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