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신경과학

Un test galvanotaxie pour l'analyse de la cinétique précurseurs neuronaux migration des cellules dans un champ appliqué de l'extérieur électrique à courant continu

Published: October 13, 2012
doi:
10.3791/4193
, ,
1Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering,University of Toronto, 2Lyndhurst Centre,Toronto Rehabilitation Institute, 3Department of Surgery,University of Toronto

Summary

Dans ce protocole, nous allons montrer comment construire des chambres personnalisées qui permettent l'application d'un champ électrique à courant continu pour permettre imagerie time-lapse de cerveau adulte dérivé de neurones translocation cellule précurseur pendant galvanotaxie.

Abstract

La découverte des cellules souches et des cellules progénitrices neurales (collectivement appelées cellules précurseurs neurales) (PNJ) dans le cerveau des mammifères adultes a conduit à un ensemble de recherches visant à utiliser les propriétés multipotentes et de prolifération de ces cellules pour le développement de stratégies neuroregenerative. Une étape cruciale pour le succès de ces stratégies est la mobilisation des PNJ vers un site de lésion consécutive à une transplantation ou exogène pour améliorer la réponse des précurseurs endogènes que l'on trouve dans la région périventriculaire du système nerveux central. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes qui favorisent, d'orienter et d'améliorer la migration PNJ. Notre travail se concentre sur l'utilisation du courant continu champs électriques (dcEFs) de promouvoir et de migration directe PNJ – un phénomène connu sous le nom galvanotaxie. Endogènes physiologiques des champs électriques fonctionnent comme des repères essentiels pour la migration cellulaire au cours du développement normal et la cicatrisation des plaies. La perturbation pharmacologique dutension du tube neural chez trans-embryons axolotl provoque de graves malformations du développement 1. Dans le contexte de la cicatrisation, le taux de réparation de la cornée blessés est directement corrélée à l'ampleur du potentiel de blessure épithéliale qui se pose après une blessure, comme le montre l'amélioration pharmacologique ou l'interruption de ce dCEF 2-3. Nous avons démontré que les adultes subissent PNJ sous-épendymaires rapide et dirigé la migration cathodique in vitro lorsqu'elles sont exposées à un dCEF appliqué de l'extérieur. Dans ce protocole, nous allons décrire les techniques de notre laboratoire pour la création d'un test galvanotaxie simple et efficace à haute résolution, observation à long terme de la translocation de cellule du corps dirigé (migration) sur un seul niveau de cellules. Ce test serait approprié pour étudier les mécanismes qui régulent la transduction dCEF dans la motilité cellulaire grâce à l'utilisation de souris transgéniques ou knock-out, courts ARN interférents ou des agonistes / antagonistes des récepteurs spécifiques.

Protocol

Toutes les procédures impliquant la manipulation des animaux ont été approuvés par l'Université de Toronto Comité de protection des animaux, conformément aux directives institutionnelles (protocole n °. 20009387). Les méthodes suivantes doivent être effectuées à l'aide des outils et des techniques stériles, dans une hotte à flux laminaire, le cas échéant. Dans le texte du protocole ci-dessous, l'expression «EFH-SFM» se réfère à un milieu sans sérum suppléme…

Representative Results

L'analyse cinématique révèle que, en présence d'une mesure de 250 mV / mm dCEF, les PNJ indifférenciées présentent galvanotaxie très rapide et dirigés vers la cathode (figure 5A, Film 1). En l'absence d'un dCEF, le mouvement aléatoire des cellules est observée (figure 5B, Film 2). A ce champ,> 98% des PNJ indifférenciées migrer pour la de 6-8 heures pour lesquelles ils sont imagés, et depuis les cellules mortes ne migrent pas ce qui suggère qu'ils r…

Discussion

Ce protocole a été adapté à partir des méthodes bien établies d'études antérieures 7-9. Galvanotactic chambres peuvent être construits en utilisant une variété de techniques différentes, y compris la construction d'un verre séparé bien pour le confinement de l'ensemencement des cellules, ou par ablation laser CO 2 pour la microfabrication de la cuvette centrale 10,11. Certaines techniques peuvent être plus laborieux ou coûteux que d'autres. Nous avons déc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est financé en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no 249669, 482986 et #) et la Fondation des maladies du Canada (subvention no 485508). Les auteurs tiennent à remercier Youssef El-Hayek et le Dr Qi Wan pour leur aide dans l'élaboration des protocoles expérimentaux.

Materials

Name of item Company Catalogue number Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl Sigma S5886 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl Sigma P5405 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3 Sigma S5761 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose Sigma G6152 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2 Sigma C7902 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin Gibco 15070
Bovine pancreas trypsin Sigma T1005
Sheep testes hyaluronidase Sigma H6254
Kynurenic acid Sigma K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor Worthington LS003086
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 21700075
30% Glucose Sigma G6152
7.5% NaHCO3 Sigma S5761
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine Gibco 25030
EGF Invitrogen PMG8041 Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF Invitrogen PHG0226 Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin Sigma H3149
Apo-transferrin R&D Systems 3188-AT 0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine Sigma P7505 Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin Sigma I5500 Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides VWR 16004
6N Hydrochloric Acid VWR BDH3204-1
High vacuum grease Dow Corning
60 mm Petri dishes Fisher Scientific 0875713A
Poly-L-lysine Sigma P4707
Matrigel BD Biosciences 354234 Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS Invitrogen 10082139 Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope Olympus CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire Alfa Aesar 11434
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Heat Inactivated FBS Sigma 16140071
PVC tubing Fisher Scientific 80000006 3/32″ID x 5/32″OD
Bleach Clorox
10 cc syringe BD 309604
18 gauge needle BD 305195
Dremel drill Dremel Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber Zeiss Axiovert-200M

Recipes

Item Volume
2M NaCl 6.2 ml
1M KCl 0.5 ml
1M MgCl2 0.32 ml
155mM NaHCO3 16.9 ml
1M Glucose 1 ml
108 mM CaCl2 0.09256 ml
Penicillin-streptomycin 1 ml
Autoclaved water 74 ml

Artificial cerebrospinal fluid

Item Volume or Mass
Artificial cerebrospinal fluid 30 ml
Bovine pancreas trypsin 40 mg
Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg
Kynurenic acid 5 mg

Trypsin Solution

Item Volume or Mass
SFM 15 ml
Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg

Trypsin Inhibitor Solution

Item Volume
Autoclaved water 37 ml
10X DMEM/F12 10 ml
30% Glucose 2 ml
7.5% NaHCO3 1.5 ml
1M HEPES 0.5 ml
Transferrin, Putrescine solution 4 ml
25 mg insulin solution 4 ml
Selenium 100 μl
Progesterone 100 μl

Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)

Item Volume
Autoclaved water 37.5 ml
10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml
30% Glucose 1 ml
7.5% NaHCO3 0.75 ml
1M HEPES 0.25 ml
Hormone mix 5 ml
L-glutamine 0.5 ml
Penicillin-streptomycin 0.5 ml

Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS

Item Volume
Matrigel 150 μl
SFM 3.6 ml

Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.

Item Volume or Mass
UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20
SFM
Heat Inactivated FBS		 8 ml
2 ml

Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.
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References

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Galvanotaxis AssayNeural Precursor Cell MigrationExternally Applied Direct Current Electric FieldNeural Stem CellsNeuroregenerative StrategiesMobilization Of NPCsLesion SiteEndogenous PrecursorsPeriventricular RegionMechanisms Of NPC MigrationDirect Current Electric Fields (dcEFs)Galvanotaxis PhenomenonPhysiological Electric FieldsCell MigrationNormal DevelopmentWound Repair

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Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field. J. Vis. Exp. (68), e4193, doi:10.3791/4193 (2012).
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