Una modificación de la EPA Método 1623 que utiliza el flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración y la Plaza de calor de disociación para detectar a base de agua<em> Cryptosporidium</em> Y<em> Esp.</em

1. Flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración Procedimiento Preparación de tampones y soluciones: La elución de soluciones (1 l): Para 1 L de agua de grado reactivo añadir 0,1 g de polifosfato de sodio, 0,1 ml de Tween-80 y 0,01 ml de antiespumante S-30. Preparar el conjunto del filtro (Figura 1) en una cabina de seguridad biológica: Inserte Masterflex I / P 73 tubos de laboratorio a través de una Masterflex I / P cabezal de la bomba Carga fácil conectarse a una Masterflex I / P de la unidad sin escobillas de precisión. Fijar el tubo a un 0-60 psi, manómetro lleno de glicerina equipado con una rama TNP conector en T aguas arriba de la cabeza de la bomba con una abrazadera de tornillo, y un conector en T HDPE aguas abajo de la cabeza de la bomba. Montar la botella retenido por la instalación de un Nalgene 53-B de llenado / venteo tapa con Masterflex L / S tubo de laboratorio de 15 y un conector en T y lo fija en un 1 botella de Nalgene L polipropileno pesada obligación. Montar Masterflex L / S 24 tubos won una pizca de la abrazadera (clamp pizca 2) y conectarlo de la botella de polietileno de alta densidad de retenido a la T-conector. Conectar el Masterflex L / S 24 tubos de laboratorio del manómetro a la Kasei Asahi Rexeed 25S de alto flujo dializador con una abrazadera de tornillo, y desde el dializador a la botella retenido. Utilice los productos a medida adaptadores DIN diseñadas para dar cabida a ¼ "tubo de ID para conectar la tubería a la ultrafiltro de fibra hueca. Montar Masterflex L / S 24 tubos de laboratorio con una pinza de pellizco (pinch clamp 1) y conectarlo a una pipeta de plástico de 10 ml con el tapón de la punta y el algodón eliminado para actuar como la línea de absorción de la muestra y luego conecte el tubo de polietileno de alta densidad a la T- conector. Colocar un extremo del tubo Masterflex laboratorio L/S-36 con una rampa de abrazadera y conecte la tubería al puerto efluente situado cerca del extremo de salida del filtro. Coloque el otro extremo en el contenedor de desechos. Añadir 0,01% (w / v) de polifosfato de sodio a la muestra 10 L de agua y se mezcla durante 3 min. Cierre la abrazadera pizca 2y quitar la tapa de ventilación de la botella retenido. Todas las abrazaderas de otros deben estar abiertos. Ajuste la dirección de la bomba para mover el fluido desde el conector en T para el manómetro de presión (a la derecha a izquierda Figura siguiente 1). Ajustar la velocidad de la bomba a 25% de la velocidad máxima y activar la bomba. Cuando la botella está retenido de 2/3 de la abrazadera, una pizca abierto 2 y volver a colocar rápidamente la tapa de ventilación de la botella retenido. Revise todas las líneas y conexiones para garantizar que no haya fugas. Lentamente aumentar la velocidad de la bomba a la tasa de filtración deseada (aproximadamente 1,5 l / min), la comprobación de fugas. Usando un cilindro graduado y un metro temporizador o flujo, comprobar la tasa de filtrado del agua que sale desde la línea de efluente (azul L / S 36 tubos en la Figura 1). Las burbujas de aire típicamente pueden formar en el extremo de salida del filtro por lo que es difícil de lograr una presión estable y la tasa de filtración. Esto se corrige apretando la línea de efluente con la mano por un momento. Esta accióngeneralmente coaxial la burbuja de aire al puerto filtrado y para salir a través de la línea de efluente. Repita cuantas veces sea necesario, teniendo en cuenta que las burbujas de aire del tamaño de guisante son a menudo inevitables. Supervisar el proceso de filtración. Medir y registrar la presión y la velocidad de filtración según sea necesario. La presión no debe exceder los 20 psi. Se recomienda que la tasa de filtración no debe exceder de 2,0 L / min. Es importante que el volumen de agua en la botella retentato ser controlados para asegurar que nunca se vacía. Es normal que el volumen para aumentar o disminuir ligeramente. Si el volumen de agua retenido en la botella cae por debajo de 1/3 lleno, a continuación, retire la tapa de ventilación y una pizca cerca de la abrazadera 2 en la línea de botella retenido. Llevar el volumen de nuevo a cerca de 2/3 de su capacidad, abra la pinza y volver a colocar rápidamente la tapa de ventilación, lo que garantiza un cierre hermético. Si el volumen retenido en la botella se cae de forma rápida y continua, a continuación, asegurar la tapa de la botella retenido es escaso y la tapa de ventilación es segura en su lugar, y que el tubing es todavía en contacto con la muestra de agua. Si estas cuestiones no se están produciendo, entonces es probable que el sello en la tapa de la botella retenido es malo y debe ser reemplazado. Cuando el recipiente de la muestra está vacía, la abrazadera pellizco inmediatamente cerrar 1, reducir la velocidad de la bomba a 20% de su máximo, retirar la tapa de ventilación de la botella retenido y cerrar la pinza rampa. Ajuste el volumen de la muestra en la botella de retenido hasta aproximadamente 200 ml por apretar o aflojar la abrazadera de la rampa. Después de que el volumen es de aproximadamente 200 ml, apretar la abrazadera de la rampa de los pasos de elución (1.11 a 1.12). Añadir 500 ml de solución de elución para el contenedor de muestras y enjuagar el interior del recipiente. Colocar la pipeta 10 ml conectada a la línea de absorción de la muestra en el recipiente que contiene la solución de elución. Asegúrese de que la abrazadera de la rampa está cerrada. Pinza sujetar una pinza y una pizca cerca de 2 por un momento de elaborar la solución de elución. Después de los 500 ml de solución de elución se redacta, Cerca de una abrazadera de apriete y la abrazadera pizca abierto 2. Dejar que la solución de elución para circular durante 5 minutos con una velocidad de bombeo de 20% de su valor máximo. Ajustar el volumen de la muestra en la botella retenido a aproximadamente 100 ml por apretar o aflojar la abrazadera rampa en la línea de efluente. Apretar la abrazadera rampa y dejar que la muestra a circular durante 1 minuto. Evite tirar del aire en el tubo, asegurando el volumen de la muestra en la botella retenido es lo suficientemente alta para cubrir la L / S 15 tubos de entrar en la botella retenido. Invertir la dirección de la bomba que obliga a la muestra en la botella retenido. Permitir que la bomba funcione en sentido inverso durante 20 segundos resultantes en un total de ~ 225 ml en la botella retenido. Apague la bomba. Retire el Masterflex I / P 73 tubo de la cabeza de la bomba y desconectar el medidor de presión. Desconecte el Masterflex L / S 24 tubos de salida de la ultrafiltro de fibra hueca. Mantener la tubería por encima de la botella retenido para obligar a cualquier muestra restante en elretenido botella. Desconecte todos los tubos de la botella y coloque la tapa de ventilación con una tapa no-ventilación. Continuar con el procedimiento de IMS / IFA con el ~ 225 ml de retenido. 2. Procedimiento de separación inmunomagnética Preparación de tampones y soluciones: Permitir que los topes incluidos en las Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia kit combinado para alcanzar la temperatura ambiente. SL-1X tampón A: Añadir 1 ml de 10X SL-tampón A a 9 ml de agua de grado reactivo. Transferir la ~ 225 ml de líquido de la botella retenido a una etiqueta 250 ml de tubo de centrífuga cónico. Lavar la botella retenido dos veces con 10 ml de agua de grado reactivo, y añadir los enjuagues para el tubo de centrífuga cónico. Centrifugar la suspensión a 1500 xg durante 15 min a 4 ° C sin freno. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de la interfase aire-agua a 5 ml por encima de la pastilla embalado por cada 0,5 ml de volumen de precipitado (es decir aspirado a 15 ml por encima de un volumen de pellets de 1,3 ml, y aspirado a 5 ml de una pastilla de 0,5 ml o menos). Fondo resuspender el sedimento en el sobrenadante por vórtex y / o una pipeta de mezcla. Transferir cada volumen de 5 ml del líquido a la cara plana Dynal L10 tubo que contiene 1 ml de cada uno de 10X tampón de SL-A y SL-10X tampón B. Lavar el tubo de centrífuga cónico dos veces con 2,5 ml de agua y añadir el reactivo de enjuague para el tubo L10, con lo que el volumen total en el tubo ml L10 a 12, incluyendo los tampones. Añadir 100 l cada uno de los bien mezclados Dynabeads resuspendidas contra el Cryptosporidium y Giardia, contra el tubo L10. Girar el tubo L10 a 18 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Coloque el lado plano del tubo L10 contra el imán MPC-6 y la roca suavemente la mano del tubo de extremo a extremo, 180 ° C durante 2 minutos. Manteniendo el tubo L10 en el imán MPC-6 con la cara de imán hacia arriba, decantar el sobrenadante lejos de la perla / (oo) quistes complejos bouº al imán. Retirar el tubo L10 del imán y añadir 0,5 ml de 1X SL-tampón A al tubo. Transferir la suspensión mediante dos lavados adicionales de 0,5 ml de 1X SL-tampón A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a cabo en el MPC-S con el imán en la posición vertical. Agite suavemente el tubo en el MPC-S del imán 180 ° durante 1 minuto. Con el imán en su lugar, aspirar el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur dirigido a la parte inferior del tubo de microcentrífuga. Añadir 1 ml de 1X PBS a la parte frontal del tubo de microcentrífuga, eliminar el imán y oscilar suavemente el tubo hasta que las perlas se volvieron a suspender. Sustituir el imán en la posición vertical y mueva suavemente el tubo 180 ° C durante 1 minuto. Aspirar el PBS enjuague, sin perturbar el sedimento talón, utilizando una pipeta Pasteur para eliminar desechos como sea posible. Eliminar el imán y añadir 50 l de agua de grado reactivo al lado posterior del tubo de microcentrífuga. Vórtice del tubo a toda velocidad durante 50 segundos,a continuación, se incuba el tubo a 80 ° C durante 10 minutos seguido por un segundo vórtice 30. Sustituir el imán en el MPC-S en la posición inclinada, la unión de las perlas para el imán y dejando los quistes (oo) en el líquido. Aplicar la suspensión del quiste (oo) a una diapositiva SingleSpot bien. Repetir paso 2,10, aplicando el líquido al mismo pozo que contiene la primera disociación. Colocar el portaobjetos en una diapositiva 37 ° C más caliente durante 1 hora para secar la suspensión a la diapositiva bien. 3. Tinción y examen Preparación de tampones y soluciones: Solución de trabajo DAPI: Añadir 25 l de solución madre DAPI (2 mg / ml en metanol) a 25 ml de 1X PBS. Tienda de acciones y soluciones de trabajo entre 1 ° C y 10 ° C en la oscuridad. Aplicar 50 l de metanol a la diapositiva y así permitir que se seque a temperatura ambiente. Añadir 50 ml de la solución DAPI de trabajo a la diapositiva bien y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente. Use un KimwiPE a la mecha de la DAPI del pozo. Aplique 50 l de EasyStain. Incubar a 35 ° C durante 30 minutos. Seque la mancha de el pozo con una Kimwipe, y luego, lentamente, añadir 300 l de tampón frío EasyStain fijación, permitiendo que fluya sobre el borde bien. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Use un Kimwipe que absorbe y expulsa el buffer del pozo y aplicar 10 l de medio EasyStain montaje. Aplique con cuidado una hoja de cubierta, la eliminación de las burbujas que se producen. Selle la hoja de la cubierta con esmalte de uñas transparente. Digitalizar toda la diapositiva utilizando el filtro FITC, en el aumento total de 200X, de ovoides o esférica color verde manzana objetos fluorescentes que se asemejan a un ooquiste o quiste. Examine todos esos objetos con el filtro de DAPI en un aumento total de 1000X y luego con la CID, también en un aumento total de 1000X. Anote el tamaño utilizando un micrómetro ocular calibrado y características morfológicas. Documentar los resultados. Nota: información adicionalinformación sobre el procedimiento original se puede encontrar en diciembre de 2005 la versión del método de la EPA 1623 12. El flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración procedimiento descrito se utiliza en lugar de la sección de 12,0 método EPA 1623. La disociación de calor modifica la Sección 13.3.3 del método EPA 1623. El procedimiento también describe un enjuague adicional PBS durante el proceso de IMS que se puede insertar en la versión de diciembre 2005 Método 1623 después de la sección 13.3.2.16. La lista completa de consumibles, reactivos y equipos utilizados para el método EPA 1623 la inclusión de estas modificaciones se enumeran en la lista de equipo. 4. Los resultados representativos Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia recuperados a través de los procesos de filtración y separación inmunomagnética se detectan mediante un análisis microscópico. En una ampliación de 200X total, cada organismo exhibe un patrón de tinción típica, el tamaño y la forma como se muestra en la Figura 2 </strong> se observó, además, usando aceite de inmersión con un aumento total de 1000X. Esto permitirá que para la medición y la identificación de cualquiera de las características típicas que definen o características atípicas que descartar una identificación positiva. El Cryptosporidium es un ovoide con objeto esférico de 4 a 6 m de diámetro que exhibe brillantes de color verde manzana de fluorescencia FITC con bordes brillantes señalados (figura 3A ). Con DAPI UV, un ooquiste exhibirá una de las categorías siguientes características típicas: la luz azul que se mancha interna con un borde verde y sin núcleos distintos (DAPI negativo), una intensa coloración interna de azul, o hasta cuatro distintas, de color azul celeste núcleos (DAPI positivo – Figura 3B). Características atípicas incluyen las desviaciones en el color, estructura o DAPI fluorescencia (por ejemplo, núcleos teñidos de más, de color rojo fluorescente las estructuras internas). Si el objeto fluorescente ha cumplido los criterios para la FITC típica y DAPI, se examina por medio de Con interferencia diferencialcontraste (CID). El objeto se examinaron para atípicas características morfológicas externas o internas, tales como la ornamentación de la pared celular, o una o dos grandes núcleos de llenado de la célula. Si las estructuras atípicas no se observan, el objeto se registra en el recuento total de IFA y se categorizan como una estructura amorfa vacío o con uno a cuatro esporozoitos presentes (Figura 3C). Del mismo modo, Giardia-como los objetos son examinados con respecto a la tinción con FITC y DAPI, así como las características de DIC, como axonemas, los organismos de la mediana, y los núcleos de los quistes de Giardia son redondos u ovoides objetos brillantes de color verde manzana, 8 -. 18 micras de largo por 5 – 15 micras de ancho con bordes vivos resaltados (Figura 3D). Con DAPI UV, el quiste de Giardia exhibirá DAPI tinción negativa, o DAPI-positivas características (Figura 3E). El objeto fluorescente es examinado por DIC para las características típicas y atípicas en la misma manera descrita para Cryptosporidium.Si las características atípicas no se observan, el objeto se registra en el recuento total de IFA y la categoría de estructura amorfa que contiene vacíos, o con uno o más tipos de estructuras internas presentes (Figura 3F). Cualquier organismo que se observa que tienen características atípicas no debe ser considerado como un quiste (oo). El análisis microscópico de muestras ambientales puede ser un reto, ya que hay organismos que pueden auto-fluorescentes o de una reacción cruzada con el FITC-conjugado anti-Cryptosporidium y / o anti-Giardia anticuerpos 1. Se recomienda que un analista de estar familiarizado con los microbios acuáticos y decenas de revisión de las diapositivas para ganar experiencia la identificación de Cryptosporidium y Giardia. Por lo menos tres (oo) quistes en la diapositiva de la tinción de control positivo debe ser caracterizado antes de cada período de sesiones en el microscopio. Muestras de control de calidad puede ser enriquecida con (oo) quistes para determinar el por ciento de recOvery para cada protozoo mediante el cálculo: (Oo) quiste porcentaje de recuperación = ((recuento de muestras de control de calidad – Cuenta de la Muestra sin marcar) / Spike) x 100. Figura 1. Representación gráfica del sistema de ultrafiltración de flujo tangencial de fibra hueca. El tubo está codificada en color para ayudar es el montaje del sistema. Figura 2. Imagen representativa de fluorescencia de Cryptosporidium y Giardia (oo) quistes. Ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia fueron teñidas con FITC anti-Cryptosporidium / Giardia anticuerpos. Flechas, quistes de Giardia, puntas de flecha, ooquistes de Cryptosporidium. Un total de cuatro ooquistes de Cryptosporidium y quistes de Giardia seis fueron encontrados en el plano de enfoque. Las muestras observablesed bajo una ampliación de 200X. . Figura 3 representativas imágenes microscópicas de los ooquistes de Cryptosporidium y quistes Giaridia utilizados para la caracterización de ooquistes de Cryptosporidium (a – c).. Brillante de color verde manzana FITC fluorescencia de objetos esféricos de 4 a 6 micras de diámetro con bordes brillantes resaltados (A) que contiene hasta cuatro distintas, de color azul celeste núcleos con DAPI (B) y de uno a cuatro esporozoitos (S) por ooquistes (C). quistes de Giardia (D – F). Brillante de color verde manzana con FITC fluorescencia de vuelta a los objetos ovoides 8 – 18 micras de largo por 5 a 15 micras de ancho con bordes vivos resaltados (D) que contienen hasta cuatro azul celeste núcleos DAPI (E) y con una o más estructura discernible tales interna como núcleos (N), el cuerpo de la mediana (M) y axonemas o (A) (F). Las flechas blancas y brillantes manzanas verdes ooquistes de Cryptosporidium y tinción de fluorescencia quistes de Giardia walls, puntas de flecha blanca, núcleos DAPI positivas. Las muestras se observa bajo magnificación 1000X.