इस प्रोटोकॉल को जलजनित का पता लगाने के लिए वैकल्पिक कदम के रूप में एक स्पर्शरेखा प्रवाह खोखला फाइबर ultrafiltration नमूना एकाग्रता प्रणाली का उपयोग और एक गर्मी हदबंदी का वर्णन<em> Cryptosporidium</em> और<em> Giardia</emEPA के 1623 विधि का उपयोग प्रजातियों.
Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.
स्पज्या का प्रवाह खोखला फाइबर ultrafiltration के cryptosporidium oocysts और पानी से Giardia अल्सर की प्रारंभिक एकाग्रता के लिए एक वैकल्पिक और प्रभावी तकनीक है. खोखला फाइबर ultrafiltration परंपरागत फिल्टर की तुलना में कम खर्चीला है. चूंकि यह के cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर के विभिन्न पानी matrices के एक विभिन्न प्रकार से ध्यान केंद्रित करने की क्षमता है यह वर्तमान निस्पंदन EPA के विधि 1623 के लिए तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए एक उपयोगी विकल्प है. सबसे अन्य निस्पंदन तरीकों के साथ के रूप में, खोखला फाइबर ultrafiltration बहुत turbid नमूनों के साथ दूषण की संभावना है. उच्च दबाव पानी फिल्टर दूषण से नतीजा होगा, इसलिए यह छानने का काम चलाने के दौरान दबाव की निगरानी के लिए सिफारिश की है. Cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर के अलावा, खोखला फाइबर ultrafiltration बैक्टीरिया और वायरस 1-3,5,8 ध्यान केंद्रित करने में सक्षम हो दिखाया गया है. खोखला फाइबर ultrafiltration ओइस विधि में utlined एक एकल नमूने में कई जीवों को ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह उल्लेखनीय है कि 200 और 250 मिलीलीटर के बीच अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए कि अतिरिक्त centrifugation कदम तो महत्वपूर्ण एकाग्रता प्रक्रिया में अंतिम कदम है, कि (ऊ) पुटी हानि में परिणाम कर सकते हैं कर रहे हैं (2.2 कदम) बचा है. हालांकि, बोतल में मात्रा भी कम ड्रॉप करने के लिए अनुमति वसूली पर प्रतिकूल प्रभाव के बाद से वहाँ पर्याप्त तरल के लिए retentate बोतल में सभी oocysts या अल्सर को मजबूर मात्रा नहीं होगा. इसलिए यह 200 और 250 मिलीलीटर के बीच अंतिम मात्रा को बनाए रखने की सिफारिश की है.
गर्मी पृथक्करण विधि 1623 में एसिड हदबंदी कदम के लिए एक विकल्प है. इस वैकल्पिक कदम के के cryptosporidium oocyst वसूली में सुधार लाने के लिए और जब भी नदी या अभिकर्मक 9 पानी से अलग विधि भिन्नता को कम दिखाया गया है. एसिड और गर्मी हदबंदी तरीकों का एक पक्ष द्वारा साइड तुलना दिखा दिया कि dissocia करने के लिए गर्मी का उपयोगते immunomagnetic मोती से जीवों दोनों cryptosporidium और Giardia के लिए उच्च मतलब वसूली का उत्पादन. इसके अलावा, cryptosporidium और Giardia वसूली की सटीक गर्मी हदबंदी साथ संसाधित नमूनों में एसिड हदबंदी 9 के साथ तुलना में बेहतर था.
एकाग्रता कदम के रूप में HFUF का समावेश करने के लिए कई जीवों को ध्यान केंद्रित करने की क्षमता प्रदान करके अधिक लचीलापन देता है. इसके अलावा यह वर्तमान विधि 1623 निस्पंदन विकल्प के लिए एक कम महंगा विकल्प है.
The authors have nothing to disclose.
हम अपने तकनीकी सहायता के लिए इस पांडुलिपि और डौग हैमिल्टन में महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए एन ग्रिम और माइकल Zimmerman धन्यवाद देना चाहूंगा.
Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
Timer | VWR | 23609-202 |
Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
Vortex | VWR | 14216-188 |
Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
Cover glass | Corning | 287018 |
EasyStain direct kit | BTF | – |
10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
FITC filter | Nikon | 96302 |
DAPI filter | Nikon | 96301 |
X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
Lens paper | Nikon | 76997 |
Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
Wypall | Kimberly Clark | 34790 |