Een<em> In vitro</em> Co-infectie model om te onderzoeken<em> Plasmodium falciparum</em>-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Let op: Experimenten met HIV-1 en Plasmodium falciparum moet worden uitgevoerd in de juiste bioveiligheidsniveau laboratoria (BSL2 voor parasieten en BSL3 voor HIV-1 en co-infecties) en speciale voorzorgen moeten genomen bij het ​​gebruik van mogelijk besmet menselijk bloed worden. 1. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) Zuivering (Gebaseerd op 8 en 9) Beginnen met verse menselijk bloed van gezonde donoren (500 ml) behandeld met anticoagulantia (heparine, citraat, zuur citraat dextrose of citraat fosfaat dextrose). Gebruik endotoxine-free reagentia bij het zuiveren en het isoleren van PBMC en in de rest van het protocol. Ontsmet de bloedzak, met inbegrip van de buis, met 70% ethanol, knip de tube en zorgvuldig het bloed over in een T150 kolf. Bereid 16 buizen met 15 ml Lymfocyten Scheiding Medium (Ficoll) per 50 ml conische tube (zorg ervoor dat Ficoll de kamertemperatuur heeft bereikt).Voorzichtig laag 30 ml vers bloed op de top. Centrifugeer 400 g gedurende 30 min bij 20 ° C met onderbroken. Tijdens het centrifugeren bereiden 8 x 50 ml conische buizen met 25 ml Balanced Salt Solution kamertemperatuur Hank's (HBSS) per buis. Voorzichtig overdragen troebel cel ring op het grensvlak (bevat PBMC) van de 50 ml buis met de HBSS (pool 2 cellen ringen per buis). Complete jaargangen tot 50 ml met HBSS. Centrifugeer 150 g gedurende 15 min bij 20 ° C met pauzes. Tijdens het centrifugeren van de bewolkte cel ring, het verzamelen van de gele bovenste laag van de Ficoll stap, het zwembad van het plasma op te vullen een 50 ml conische buis. Inactiveren aanvullen plasma door het verwarmen van de buis 50 ml bij 56 ° C gedurende 30 min en 10 min centrifugeren bij 1800 x g. Houd supernatant (bevat verdund autoloog plasma kan worden gebruikt als aanvulling op medium latere stappen). Verwijder voorzichtig het supernatant af en resuspend de celpellet van stap 1,7 in 25 ml HBSS en pool 2 pellets per 50 ml buis. Spin 300 g gedurende 8 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 10 ml HBSS en zwembad in een 50 ml buis. Neem een ​​hoeveelheid, uit te voeren trypanblauw uitsluiting naar sterfte beoordelen en tel dan PBMC. Volledige volume van 50 ml met HBSS en centrifuge 10 min bij 300 x g. Verwijder de supernatant en de cellen te resuspenderen in RPMI 1640 te 5×10 6 cellen / ml (een dient ongeveer 400-500 x 10 6 PBMC verkrijgen 500 ml bloed). 2. Monocyten-ontwikkelde macrofagen (MDM) Differentiatie (Gebaseerd op 8 en 9) Seed ongeveer 1,25 x 10 8 PBMC in 15 cm gerechten met RPMI 1640 (25 ml / gerecht). Laat cellen 1-2 uur hechten bij 37 ° C met 5% CO2 atmosfeer. Overdracht niet-aangehechte cellen in een nieuwe fles en was bord met 15 ml endotoxine vrij PBS twee keer (5min, 300 xg). De aangehechte cellen geïsoleerde monocyten. Om vers geïsoleerde monocyten om te differentiëren in MDM, voeg 20 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 5% autoloog plasma (vanaf stap 1.8). Voeg menselijke recombinant macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF, 25 ng / ml) en penicilline / streptomycine oplossing (PS, 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine). Incubeer gedurende 2 dagen, te wijzigen medium en incubeer 2-3 extra dagen bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer. Verwijder oude medium en was met endotoxine vrij PBS een keer, voeg de PBS voorzichtig en zuig onmiddellijk. Om volledig gedifferentieerde MDM losmaken behandelen cellen ~ 7 ml Accutase (Accutase, een commercieel verkrijgbaar mengsel van proteasen en collagenolytische activiteit het losmaken van cellen uit de plastic schaal mogelijk) 15-20 minuten bij 37 ° C in een 5% CO 2 sfeer, schud halverwege de tijd. Voeg 3-5 ml autoloog plasma (vanaf stap 1.8) in elke plaat (om de bescherming van de cellen, terwijlschrapen). Voorzichtig schrapen cellen ervoor te zorgen dat de middellange-de cellen te allen tijde en transfer / zwembad in een 50 ml buis omvat. Spoel platen met endotoxine vrij PBS om te herstellen zo veel cellen mogelijk te maken. Spin 5 min bij 200 xg, gooi supernatant. Resuspendeer in 5 ml MDM kweekmedium (RPMI 1640 aangevuld met 10% complement-geïnactiveerd foetaal koeienserum (iFBS), PS, 25 mM HEPES) en aantal cellen (MDM opbrengst meestal 2-8% van de totale PBMC). Let op: een hoeveelheid van MDM kunnen worden genomen in deze stap om celpopulatie zuiverheid te beoordelen door middel van flowcytometrie, meestal 99% van de verkregen MDM express CD14. Zaad 1×10 5 MDM in 600 ul van MDM kweekmedium per well in 24-well platen. Incubeer nacht bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer bij infecties. 3. Productie en kwantificering van HIV-1 virale Voorraden Produceer virale voorraden met behulp van calciumfosfaat transfectie in HEK293T-cellen Follovleugel van het protocol van Fortin et al.. 10. Met het oog op enkele cyclus virussen met de luciferase-reporter-gen dat codeert, co-transfecteren HEK293T cellen te verkrijgen met ofwel 20 ug NL4.3 Luc + Env – R + en 10 ug van pHCMV-G, of 15 microgram NL4.3 Luc + Env – R + en 15 microgram pJRFL env. Gebruik 30 ug NL4.3 Luc + Env – R + onder controle glycoproteïne-deficiënte virussen te genereren. Voor de volledige replicatieve virus, gebruik 30 ug NL4.3Bal env. De vectoren pHCMV-G en pJRFL env coderen de enveloppe glycoproteïnen van vesiculaire stomatitis virus (VSV-G) en van een CXCR5-troop HIV-1 (anders dan NL4.3Bal env), respectievelijk. Meer informatie over de plasmiden worden verkregen 8. Plasmiden kan worden verkregen via de NIH AIDS Research and Reference Program (NIAID, NIH). Kwantificeer alle virale voorraden met behulp van ELISA voor de HIV-1 p24 capside-eiwit 11En verifiëren alvorens hun aanstekelijke potentieel te gebruiken. Wij evalueren de infectiviteit van onze virusvoorraden behulp van TZM-bl indicator cellen 12. 4. Cultuur van Plasmodium falciparum parasieten (gebaseerd op 13) 4.1 Algemene cultuur en het onderhoud van parasieten Houd P. falciparum 3D7 aseksuele parasieten in humane erythrocyten (bloedgroep O +) in een 4% hematocriet in RPMI 1640 (gebufferd met 25 mM HEPES en 25 mM NaHCO 3) aangevuld met 0,5% (w / v) Albumax II, 25 ug / ml gentamicine en 370μM hypoxanthine bij 37 ° C in een gasmengsel van 1% zuurstof / 5% koolstofdioxide in stikstof. Parasitemie kan worden gevolgd door het maken van een dun uitstrijkje van de cultuur en de kleuren met een 15% Giemsa oplossing. Zorg altijd voor een niet-geïnfecteerde rode bloedcellen (uRBC) cultuur schaal in de dezelfde voorwaarden als parasieten om te gebruiken als controle. Aan de late fase parasit te verkrijgenes (trofozoïeten / begin schizonten), synchroniseren van de parasieten als volgt: 4,2 Parasite synchronisatie In de ochtend, oogsten de parasiet cultuur, spin 5 min bij 300 xg en verwijder het supernatant. Resuspendeer in 5 vol celvolumes met 5% (w / v) D-sorbitol en incubeer 5 min bij 37 ° C. Spin 5 minuten bij 300 x g, gooi supernatant, Resuspendeer pellet in 30 ml kweekmedium en zet terug in de incubator. Ongeveer 8 uur later, herhaalt u de stappen 4.2.1 tot 4.2.3, om goed gesynchroniseerd parasieten te verkrijgen. Late parasieten (trofozoïeten / begin schizonten) kan vervolgens worden geoogst de volgende ochtend het experiment te voeren. Voorafgaand aan zuivering, uit te voeren Giemsa kleuring te levenscyclus podium te bevestigen. 4,3 Plasmodium falciparum-geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBC) zuivering Steriliseer de VarioMacs afscheider (stand en magneet) met 70% ethanol en pkant onder de biologische kap. Bevestig de drie-weg kraan om CS kolom bodem. Snijd het uiteinde van de naald plastic beschermer met de Miltenyi speciale frees en bevestig de naald aan de kraan beneden. Zet de kolom in de magneet voorzichtig. Verwijder luchtbellen in de kolom door langzaam 10 ml van MDM kweekmedium met kit ingesloten spuit geschroefd aan de linkerkant van de afsluiter. Was kolom met ~ 20 ml MDM kweekmedium. RBC oogst van de cultuur plaat, een keer wassen met 10 ml MDM medium (300 xg, 5 min) en resuspendeer de RBC pellet in 12 ml MDM kweekmedium. Voeg langzaam naar kolom en laat de suspensie stroom door (alleen geïnfecteerde rode bloedcellen bevatten parasieten in de trofozoïet of schizont fase gehandhaafd door het magnetische veld door de aanwezigheid van hemozoin kristallen). Was eenmaal met 20 ml medium en stoppen vloeistofstroom wanneer zij tot de witte schijf boven de kolom. Verwijder de kolom van de magneet en elueer iRBC in een schone steriele buis met 12 ml MDM kweekmedium. Smeer een deel van het herstelde iRBC en uit te voeren Giemsa kleuring te levenscyclus podium te bevestigen. Tel hersteld iRBC met behulp van een hemocytometer (geïsoleerde RBC zijn 100% iRBC). Pellet-cellen (300 xg, 5 min), gooi supernatant en de behandeling van cellen met 500 pi verse AB + menselijk serum (opsonisch stap 14). Gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Was eenmaal met 10 ml MDM kweekmedium (300 x g, 5 min), en resuspendeer iRBC tot de gewenste concentratie. Meestal zal een 10% parasitemie 15 cm cultuur schotel geeft ongeveer ~ 0,5-1×10 8 strak gesynchroniseerde iRBC. 5. Blootstelling van MDM naar Plasmodium falciparum Om te MDM uRBC of iRBC bloot moeten cellen worden geresuspendeerd in MDM kweekmedium om een ​​verhouding van uRBC / iRBC verkrijgen: MDM van 75:1. In eerdervoorbereide 24-well platen met MDM, voeg de juiste RBC schorsing volume aan elke well. Voer alle experimenten in drievoud. Incubeer co-culturen gedurende 4 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Was de cellen met 600 pi van endotoxine vrij PBS 3 keer voorzichtig voeg de PBS en zuig onmiddellijk. Om de resterende RBC lyseren, was de putten door het toevoegen van 200 pi van ijs-koud steriel water voor 20 sec en aspiratie. Voeg 600 pi MDM kweekmedium en geïncubeerd 24 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. 6. Infectie van MDM met een volledig replicatieve HIV-1 Om het effect van P. beoordelen falciparum op HIV-1 replicatie in MDM, toevoegen volgens het schema aangegeven in fig. 1A, 10 ng van p24 (in 300 ul MDM media) NL4.3Bal env virussen in de geschikte putjes, enkel nog MDM-medium in controleputjes . Incubeer 2 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Was de cellen met endotoxine vrij PBS 3 keer voorzichtig voeg de PBS en zuig onmiddellijk. Voeg 600 pi vers MDM-medium per well. Incuberen bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Bij dag 3, 6, 9 en 12 na de start van virale infectie, oogst 200 pi van elke supernatant, toevoegen van 200 ul vers medium MDM daarna. Houd geoogst supernatanten bij -20 ° C voor kwantificering van de belangrijkste capside HIV-1 p24 proteïne door ELISA na Fortin et al.. 10. 7. Infectie van MDM met Single Cycle Virus Encoding Luciferase Om de parasiet effect op HIV-1 genexpressie in MDM bepalen toevoegen volgens het schema aangegeven in figuur 1B, 10 ng p24 (in 300 pl medium MDM) van hetzij NL4.3 Luc + Env – R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) of NL4.3 Luc +Env – R + virussen in de overeenkomstige putjes. Incubeer 2 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Was de cellen met 600 pi van endotoxine vrij PBS 3 keer voorzichtig voeg de PBS en zuig onmiddellijk. Voeg 600 pi vers MDM-medium per well. Incuberen bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. Verwijder het medium 72 uur na infectie en voeg 200 ul lysisbuffer 1X (meegeleverd met de luciferase assay kit). Laat de cellen bij kamertemperatuur lyseren onder voorzichtig schudden. Bewaren bij -20 ° C. Dooi de plaat en breng 40 pi van het lysaat een 96-well plaat luminometer en voeg 100 ul luciferase substraat (die met de luciferase-test kit) en meet de luciferase (vuurvlieg luciferase) activiteit in een luminometer volgens de instructies van de fabrikant. 8. Representatieve resultaten Met behulp van onze co-infectie model, laten we zien dat exposure P. falciparum in het MDM vermindert hun vatbaarheid voor HIV-1 infectie. Inderdaad, een significante reductie (p <0,05, ANOVA 2, dag 12) tot het vrijkomen van virusdeeltjes, zoals gemeten door HIV-1 p24 capside-eiwit in de supernatant werd waargenomen in MDM voorbehandeld met parasieten (Figuur 2A). Deze waarneming is bevestigd cellen geïnfecteerd met virussen die codeert voor een luciferase-reportergen. MDM infectie met deze virussen herbergen een exogeen VSV-G of HIV-1 glycoproteïnen tot significant (p <0,05, Student's t-test) minder luciferase in cellen blootgesteld aan P. falciparum (Figuur 2B). Opmerkelijk is dat VSV-G-pseudogetypeerde virussen veel groter dan de luciferaseactiviteit JRFLenv tegenhangers opgeleverd, is vanwege de grotere infectie-efficiëntie van VSV-G pseudogetypeerde deeltjes 15. Gezien het feit dat parasiet blootstelling aan MDM effecten beide soorten virussen, duidt dit erop dat het enige stap in het virale gen-ex invloedpression (Figuur 2B). Het is belangrijk te vermelden dat levensvatbaarheid van de cellen werd niet beïnvloed door MDM blootstelling aan iRBC (gegevens niet getoond), wat aangeeft dat de waargenomen remming specifiek is en niet door celsterfte. Figuur 1. A) Plate regeling voor MDM infectie met een volledig replicerende virus Mock:. Niet-geïnfecteerde cellen. uRBC: cellen blootgesteld aan niet-geïnfecteerde rode bloedcellen. iRBC: cellen blootgesteld aan Plasmodium falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen. Bal: cellen geïnfecteerd met NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Cellen blootgesteld aan uRBC en geïnfecteerd met NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Cellen blootgesteld aan iRBC en geïnfecteerd met NL4.3Bal env B) Plate regeling voor MDM infectie met enkele cyclus luciferase-codering virus Mock:. niet-geïnfecteerde cellen. uRBC: cellen blootgesteld aan niet-geïnfecteerde rode bloedcellen. iRBC: cellen blootgesteld aan Plasmodium falciparum-infected rode bloedcellen. Δenv: cellen geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + JRFL:. Cellen geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env). VSV-G: cellen geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. cellen blootgesteld aan uRBC en geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: cellen blootgesteld aan iRBC en geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + JRFL / uRBC: cellen blootgesteld aan uRBC en geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: cellen blootgesteld aan iRBC en geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: cellen blootgesteld aan uRBC en geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-G) vsv-g/iRBC:. cellen blootgesteld aan iRBC en geïnfecteerd met NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-g). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> Figuur 2. . A) Effect van Plasmodium falciparum op HIV-1 virus productie in MDM MDM blootgesteld aan uRBC of iRBC een verhouding 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) gedurende 4 uur en grondig gewassen. Cellen werden geïnfecteerd met 10ng van NL4.3Bal env p24 gedurende 2 uur. Virale productie werd door ELISA voor HIV-1 p24 in celvrije bovendrijvende op verschillende tijdstippen na de eerste virale infectie. Een representatief experiment wordt getoond B) Effect van Plasmodium falciparum op HIV-1 virale transcriptie in MDM MDM waren geïnfecteerd met uRBC of iRBC in een verhouding 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). De cellen werden vervolgens geïnfecteerd met 10ng van p24 van enkelvoudige cyclus virus (ofwel NL4.3 Luc + Env – R +, NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) of NL4.3 Luc + Env – R + (VSV- g)). Luciferase-expressie werd geëvalueerd in cellysaten 72 uur na de eerste virus. Een representatief experiment weergegeven.