و<em> في المختبر</em> المشارك عدوى نموذج لدراسة<em> المتصورة المنجلية</em> HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي
Summary
لقد قمنا بتطوير<em> في المختبر</em> الملاريا HIV-1 المشاركة في عدوى نموذج لدراسة تأثير<em> المتصورة المنجلية</em> على دورة HIV-1 تنسخي في الإنسان الضامة الوحيدات المستمدة من الابتدائي. ويمكن بسهولة لهذا النظام تنوعا أن تتكيف مع غيرها من أنواع الخلايا الأساسية عرضة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1.
Abstract
المتصورة المنجلية، العامل المسبب الاكثر دموية شكل من الملاريا، وفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) هي من بين المشاكل الصحية الأكثر أهمية في جميع أنحاء العالم، بأنها مسؤولة عن ما مجموعه 4 ملايين حالة وفاة سنويا 1. ما زال يجهل الكثير بسبب تداخلها واسعة في المناطق النامية، ولا سيما في أفريقيا جنوب الصحراء، وشارك في الإصابات بمرض الملاريا، وفيروس نقص المناعة البشرية 1-شائعة، ولكن التفاعل بين هذين المرضين. وأشارت التقارير الوبائية أن عدوى الملاريا يعزز عابر HIV-1 ويزيد من تكرار الحمل HIV-1 الفيروسية في المشاركة في الأفراد المصابين 2،3. لأن هذا viremia يبقى عالية لعدة أسابيع بعد العلاج مع الأدوية المضادة للملاريا، ويمكن لهذه الظاهرة يكون لها تأثير على تطور المرض وانتقال العدوى.
وقد تم دراسة الآليات المناعية الخلوية وراء هذه الملاحظات نادرا فقط. القليلة في المختبر دراسات investigating تأثير الملاريا على HIV-1 أظهرت أن التعرض لمستضدات الملاريا قابل للذوبان يمكن أن تزيد من عدوى HIV-1 وإعادة تنشيط في الخلايا المناعية. ومع ذلك، وتستخدم هذه الدراسات مقتطفات خلية كاملة من بي. طفيليات المنجلية مرحلة المتقسمة والخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC)، مما يجعل من الصعب فك أي مكون ملاريا (ق) كان مسؤولا عن الآثار الملحوظة وما الخلايا المضيف الهدف كان 4،5. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي تعرض من غير ناضجة الخلايا الجذعية المستمدة من الوحيدات في هيموزوين الصباغ ملاريا زيادة قدرتها على نقل HIV-1 لخلايا CD4 + T 6،7، ولكنها انخفضت عدوى HIV-1 من 8 الضامة. لتسليط الضوء على هذه العملية المعقدة، وتحليل منهجي للتفاعلات بين طفيلي الملاريا وHIV-1 في الإنسان ذات الصلة مجموعات سكانية مختلفة الخلية الأولية وهناك حاجة خطيرة.
عدة تقنيات للتحقيق في تأثير Hوقد وصفت IV-1 على البلعمة من الكائنات الحية الدقيقة وتأثير العوامل الممرضة مثل على النسخ المتماثل-1 فيروس نقص المناعة البشرية. نقدم هنا وسيلة للتحقيق في الآثار المترتبة على P. المنجلية المصابة كرات الدم الحمراء على تكرار HIV-1 في الإنسان الضامة الوحيدات المستمدة من الابتدائي. ويتم رصد تأثير التعرض للطفيلي على HIV-1 النسخي / متعدية أحداث باستخدام الفيروسات دورة واحدة في pseudotyped التي جين مراسل luciferase حلت محل الجينات إنفيرومنتل بينما يتحدد تأثير على كمية من فيروس صدر عن الضامة المصابة عن طريق قياس HIV-1 بروتين P24 قفيصة بواسطة ELISA في supernatants الخلية.
Protocol
Discussion
وقد بينت لنا هنا نهجين مختلفين لتحليل الآثار المترتبة على طفيل الملاريا في دورة HIV-1 الفيروسية، أي إما عن طريق تحليل التعبير الجيني الفيروسي أو ذرية إنتاج فيروس وتكرارها في الوحيدات المشتقة من البلاعم. وقد استخدمت أساليب مماثلة لغيرها من فيروس نقص المناعة البشرية-1-طفيلي شارك في التهابات 16. ومع ذلك، فإن هذه البيانات الجديدة هي خطوة إلى الأمام في التحقيق في الملاريا HIV-1 المشاركة في الالتهابات. وفي الواقع، Diou وآخرون درس (8) وتأثير هيموزوين، طفيليات لا يعيش، على HIV-1 تكرارها؛ بالاتفاق مع نتائجنا، لاحظوا أن هيموزوين كان في حد ذاته كافيا لكبح الانتاج الفيروسية من قبل أطباء العالم، وليس MDMs.
استخدام تخطيط صفها التجريبية، لاحظنا أن P. المنجلية يمارس تأثيرات واضحة ضارة على دورة HIV-1 تنسخي في الضامة: لوحظ تثبيط كبير من الانتاج الفيروسية في الضامة مسبقا يتعرضون للطفيليات (الارقام ..ويتضح ه 2A)، ولها تأثير محدد للطفيل في النسخ الفيروسية في الشكل 2B. ومع ذلك، لا يمكننا أن نترك أي آثار إضافية للطفيل على دخول الفيروس أو الانصهار (decapsidation)، أو في مرحلة ما بعد الاندماج آليات، مثل تخليق البروتين أو فيروسي الجمعية الجسيمات والناشئين. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن يتم الحصول على تأثير مختلف على HIV-1 تكرارها إذا أضيفت طفيلي إما في نفس الوقت أو بعد الإصابة MDM مع الفيروس.
لدينا في نموذج التعاون عدوى المختبر يوفر أداة قوية لإجراء تحقيقات مفصلة من HIV-1 / P. المنجلية التفاعلات في الخلية المضيفة. على سبيل المثال، فإن الجمع بين هذا التصميم التجريبي مع تقنيات أخرى مثل كمية PCR الوقت الحقيقي، والتي يمكن استهدافها وتحديد خطوات محددة في retrotranscription الفيروسية والفيروسية التكامل الجينوم إلى المضيف جينوم الخلية، ممكنة جدا، وينبغي أن تسفر عن مزيد من الإعلاميينghts في الآليات التي تشارك في الأمراض المشتركة. وعلاوة على ذلك، فحوصات محددة لتقييم الخطوات في وقت مبكر من دورة الفيروسي (فيروسي الانصهار، وتحديد الكميات decapsidation دخول،) ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الأساسية لتحليل مزيد من التأثير على تكاثر الفيروس. هذه التعديلات تظهر مدى مرونة هذا البروتوكول والمتعلقة HIV-1 تحديد الكميات والكشف: في الواقع، حتى معيار تحديد الكميات المنتسخة HIV-1 العكسي فحوصات باستخدام التريتيوم المسمى النيوكليوتيدات يمكن أن تحل محل تصور لإليسا لفيروس نقص المناعة البشرية 1-P24. بالإضافة إلى MDM، ونحن نتوقع أن يكون لدينا نظام للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى ذات الصلة لفيروس نقص المناعة البشرية-1-الملاريا التفاعلات، مثل وحيدات الخلايا الجذعية. حقيقة أن MDM هي خلايا ملتصقة يسهل التلاعب بهم، والسماح لغسل سهلة للخروج من iRBC التي لم تؤخذ في، أو التي هي على اتصال مع أطباء العالم، دون أن يلغي أي الضامة. وهذه ميزة لا ينطبق على الخلايا الجذعية وحيدات، والتي يتم تربيتها في التعليق، تعقيد حد ذاتهاparation من iRBC uRBC والحرة مع مثل هذه الخلايا، ونحن نعالج هذه المسألة حاليا. يمكن أن نظامنا يكون من المفيد أيضا لدراسة التفاعلات أكثر تعقيدا مثل آثار الخلايا المشتقة من الوحيدات المتصورة للتعرض على الدورة HIV-1 فيروسي في الخلايا المناعية الأخرى مثل CD4 إيجابية الخلايا التائية في المشاركة في ثقافة التجارب. أخيرا، يمكن أن لدينا بروتوكول تكون مناسبة لتجارب تبحث في تأثير P. iRBCs المنجلية في تنشيط-1 فيروس نقص المناعة البشرية في PBMC للأفراد HIV-1 المصابة.
بيان الأخلاق
وقد تم الحصول على الإنسان PBMC من الدم من المتبرعين الأصحاء، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات علم الأحياء في مركز Hospitalier دي مركز أبحاث جامعة L'لافال. تم الحصول على موافقة خطية من جميع المتبرعين بالدم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة من خلال محفز المشارك العدوى ومنح المشارك حالة مرضية مختلفة. وقدم كرات الدم الحمراء الإنسان من قبل Hospitalier مركز دي بنك جامعة لافال L'الدم.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
| PBS-endotoxin free | Sigma | D8662 | |
| FBS | Wisent | 080-150 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
| Albumax II | Gibco | 11021-037 | Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized |
| Lymphocyte separation medium | Multicell | 305-010-CL | |
| White luminometer plates | Promega | Z3291 | |
| CS Macs separation columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
| VarioMacs separator | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Wisent | 450-201-EL | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.1830 | |
| 24-Well Cell Culture Plates | BD Falcon | 353047 | |
| 150 x 20 mm culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | |
| M-CSF | Genscript | Z02001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Human serum AB+ | Valley Biomedical | HP1022 | |
| HBSS | Wisent | 311-505-CL | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
| Human red blood cells | Obtained purified from CHUL blood bank. |
References
- WHO. . World Malaria Report. , (2005).
- Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365, 233-240 (2005).
- Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa. Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).
- Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).
- Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults. Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).
- Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication. J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).
- Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype. Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).
- Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection. Virology. 395, 56-66 (2009).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of human macrophages. Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).
- Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193, 673-675 (1976).
- Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood. 80, 801-808 (1992).
- Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).
- Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network. Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).
