Un<em> In vitro</em> Co-infección modelo para estudiar<em> Plasmodium falciparum</em>-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Nota: Los experimentos con el VIH-1 y Plasmodium falciparum se debe realizar en el adecuado nivel de laboratorios de bioseguridad (BSL2 para los parásitos, y BSL3 para el VIH-1 y coinfecciones) y la precaución se debe tener especial cuando se utiliza la sangre humana potencialmente infectados. 1. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) Purificación (Basado en 8 y 9) Comienza con sangre humana fresca de donantes sanos (500 ml) tratadas con anticoagulantes (heparina, citrato, ácido dextrosa citrato o citrato fosfato dextrosa). El uso libre de endotoxinas reactivos cuando la purificación y aislamiento de CMSP y en el resto del protocolo. Desinfecte la bolsa de sangre, incluyendo el tubo, con el 70% de etanol, cortar el tubo y transferir cuidadosamente la sangre en un frasco T150. Preparar 16 tubos con 15 ml de medio de separación linfocitos (Ficoll) por cada 50 ml tubo cónico (asegúrese de que Ficoll ha alcanzado la temperatura ambiente).Con cuidado, la capa de 30 ml de sangre fresca en la parte superior. Se centrifuga a 400 xg durante 30 min a 20 ° C con rompe. Durante la centrifugación, preparar 8 x 50 ml tubos cónicos con 25 ml de solución salina equilibrada de la temperatura ambiente de Hank (HBSS) por tubo. Cuidadosamente transferir el anillo de células nublado en la interfase (contiene PBMC) al tubo de 50 ml que contiene el HBSS (piscina 2 anillos de células por tubo). Completar volúmenes de hasta 50 ml con HBSS. Se centrifuga a 150 xg durante 15 min a 20 ° C con saltos en. Durante la centrifugación del anillo de células nublado, recoger la capa superior amarilla de la etapa de Ficoll, la piscina de plasma para llenar un tubo cónico de 50 ml. Inactivar el complemento en el plasma mediante el calentamiento del tubo de 50 ml a 56 ° C durante 30 min y 10 min a girar 1.800 x g. Mantener el sobrenadante (contiene plasma autólogo diluyó que se puede utilizar como suplemento de medio en pasos posteriores). Retire con cuidado el sobrenadante y resuspensiónd el sedimento celular desde el paso de 1,7 en 25 ml de HBSS y 2 piscina gránulos por tubo de 50 ml. Gira a 300 xg durante 8 minutos a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante con cuidado y volver a suspender los pellets en 10 ml de HBSS y piscina en un tubo de 50 ml. Tomar una alícuota, lleve a cabo la exclusión azul tripán para evaluar la mortalidad y luego contar PBMC. Volumen completo a 50 ml con HBSS y centrifugado 10 min a 300 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI 1640 a 5×10 6 células / ml (se debe obtener alrededor de 400 a 500 x 10 6 PBMC de 500 ml de sangre). 2. Los monocitos-macrófagos derivados (MDM) Diferenciación (Basado en 8 y 9) Semillas de aproximadamente 1,25 x 10 8 PBMC en 15 platos cm con medio RPMI 1640 (25 ml / placa). Que las células se adhieran durante 1-2 horas a 37 ° C con 5% atmósfera de CO 2. Transferir las células no adheridas en un matraz de nuevo y se lava la placa con 15 ml dos veces endotoxina libre de PBS (5min, 300 xg). Las células adheridas son monocitos aislados. Para permitir que los monocitos recién aisladas de diferenciarse en MDM, añadir 20 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 5% de plasma autólogo (del paso 1,8). Añadir humana recombinante de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, 25 ng / ml) y solución de penicilina / estreptomicina (PS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar durante 2 días, cambie a medio e incubar 2-3 días adicionales a 37 ° C en 5% atmósfera de CO 2. Retire medio viejo y lavar con endotoxina libre de una vez PBS, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Para separar MDM totalmente diferenciado, tratar las células con ~ Accutase 7 ml (Accutase, una mezcla comercialmente disponible de las proteasas y la actividad colagenolítica que permiten el desprendimiento de células de la placa de plástico) durante 15-20 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera, el rock suave a media hora. Agregar 3.5 ml de plasma autólogo (del paso 1.8) en cada plato (para ayudar a proteger las células, mientras queraspando). Raspe suavemente las células que hacen que ese medio cubre las células de todos los tiempos y la transferencia de la piscina / en un tubo de 50 ml. Lavar las placas con PBS libre de endotoxina para recuperar mayor cantidad de células posible. Gira de 5 minutos a 200 xg, desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 5 ml de medio de cultivo MDM (RPMI 1640 suplementado con complemento inactivado por 10% de suero fetal bovino (OFI), PS, HEPES 25 mM) y cuentan las células (MDM producen generalmente 2-8% del total de CMSP). Nota: una parte alícuota de MDM podrían tomarse en este paso para evaluar la pureza de la población de células por citometría de flujo, por lo general 99% de las MDM obtenido expresa CD14. Semilla 1×10 5 MDM en 600 l de medio de cultivo MDM por pocillo en placas de 24 pocillos. Incubar durante una noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera antes de infecciones. 3. Producción y cuantificación de VIH-1 en las poblaciones virales Producir reservas de virus utilizando la transfección de fosfato de calcio en las células HEK293T Folloala el protocolo de Fortín et al. 10. Con el fin de obtener virus individuales del ciclo que contienen el gen informador de luciferasa-codificación, co-transfectar células HEK293T con cualquiera de 20 g NL4.3 Luc + Env – R + y 10 g de pHCMV-G, o 15 g de NL4.3 Luc Env + – + R y 15 g de pJRFL env. Utilizar 30 g de NL4.3 Luc + Env – I + para generar control deficientes glicoproteína-virus. Para que el virus replicativa completamente, usar 30 g de NL4.3Bal env. Los vectores pHCMV-G y env pJRFL codificar las glicoproteínas de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y de un CXCR5-trópico VIH-1 (diferente de NL4.3Bal env), respectivamente. Información adicional sobre los plásmidos se pueden obtener a partir de 8. Los plásmidos se pueden obtener a través de la Investigación y el Programa de SIDA de los NIH de referencia (NIAID, NIH). Cuantificar todas las poblaciones virales por ELISA para la proteína de la cápside del VIH-1 p24 11, Y verificar su potencial infeccioso antes de su uso. Evaluamos la capacidad infecciosa de las poblaciones de nuestros virus a través del uso de células indicadoras TZM-BL 12. 4. Cultura de los parásitos Plasmodium falciparum (Basado en 13) 4.1 La cultura general y el mantenimiento de los parásitos Mantener P. falciparum 3D7 parásitos etapa asexual en eritrocitos humanos (grupo sanguíneo O +) en un hematocrito 4% en RPMI 1640 (tamponada con HEPES 25 mM y 25 mM NaHCO 3) suplementado con Albumax 0,5% (w / v) de II, 25 ug / ml de gentamicina e hipoxantina 370μM a 37 ° C en una mezcla de gas de 1% de oxígeno / 5% de dióxido de carbono en nitrógeno. Parasitemia se puede controlar mediante una capa delgada de la cultura y la tinción con una solución de Giemsa 15%. Siempre mantener un células no infectadas rojas de la sangre (uRBC) plato de cultivo en las mismas condiciones que los parásitos de usar como un control. Para obtener parasit última etapaes (trofozoitos o esquizontes primeros), sincronizar los parásitos de la siguiente manera: 4.2 Parásitos de sincronización Por la mañana, la cosecha de la cultura parásito, giro 5 minutos a 300 xg y descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 5 volúmenes de células empaquetadas con 5% (w / v) de D-sorbitol e incubar 5 min a 37 ° C. Gira de 5 minutos a 300 x g, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 30 ml de medio de cultivo y volver a poner en la incubadora. Aproximadamente 8 horas más tarde, repita los pasos 4.2.1 a 4.2.3 a fin de obtener los parásitos bien sincronizados. Los parásitos de la etapa tardía (trofozoitos o esquizontes primeros), entonces se puede cosechar a la mañana siguiente para llevar a cabo el experimento. Antes de la purificación, realizar la tinción de Giemsa para confirmar la etapa del ciclo de vida. 4.3 Plasmodium falciparum-los glóbulos rojos infectados (iRBC) purificación Esterilizar el separador VarioMacs (soporte y un imán) con un 70% de etanol y pencaje que bajo el capó biológica. Fije la llave de tres vías de fondo de la columna CS. Cortar el extremo del protector de aguja de plástico con el cortador Miltenyi especial y fijar la aguja a la parte inferior llave de paso. Bloqueo de la columna en el imán con cuidado. Eliminar todas las burbujas de aire en la columna por inyectando lentamente 10 ml de medio de cultivo MDM con la jeringa-kit cerrado atornillado en el lado izquierdo de la llave de paso. Lavar la columna con ~ 20 ml de medio de cultivo MDM. Cosecha de glóbulos rojos de la placa de cultivo, se lava una vez con 10 ml de medio de MDM (300 xg, 5 min) y resuspender el precipitado de glóbulos rojos en 12 ml de medio de cultivo MDM. Añadir lentamente a la columna y dejar que el flujo de suspensión a través de (sólo infectadas células rojas de la sangre que contienen parásitos en el trofozoíto o etapa esquizonte será retenido por el campo magnético debido a la presencia de cristales hemozoína). Lavar una vez con 20 ml de medio y detener el flujo de líquido cuando alcanza el disco blanco en la parte superior de la columna. Quitar la columna del imán y iRBC eluyen en un tubo limpio estéril con 12 ml de medio de cultivo MDM. Frotis de una alícuota de la iRBC recuperó y realizar la tinción de Giemsa para confirmar la etapa del ciclo de vida. Cuente recuperó iRBC utilizando un hemocitómetro (aislado RBC son 100% iRBC). Las células de pellets (300 xg, 5 min), desechar el sobrenadante y tratar las células con 500 l fresca AB + suero humano (opsonización paso 14). Incubar durante 30 min a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. Lavar una vez con 10 ml de medio de cultivo MDM (300 x g, 5 min), y volver a suspender iRBC a la concentración deseada. Por lo general, una parasitemia 10% 15 cm placa de cultivo más o menos da ~ 0.5-1×10 8 iRBC bien sincronizados. 5. La exposición de los MDM a Plasmodium falciparum Para exponer la MDM para uRBC o iRBC, las células deben ser resuspendidas en medio de cultivo MDM con el fin de obtener una relación de uRBC / iRBC: MDM de 75:1. En previamentepreparadas placas de 24 pocillos que contienen MDM, añadir un volumen adecuado de suspensión de glóbulos rojos a cada pocillo. Lleve a cabo todos los experimentos por triplicado. Incubar co-cultivos de 4 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. Se lavan las células con 600 l de PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Para el resto de lisar glóbulos rojos, lavar los pocillos añadiendo 200 l de helado de agua estéril durante 20 segundos y aspirado. Añadir 600 l medio de la cultura MDM e incubar 24 horas a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera. 6. Infección de MDM con un replicativa completamente VIH-1 A fin de evaluar el efecto de P. falciparum en la replicación del VIH-1 en MDM, añadir, según el esquema descrito en la Figura 1A, 10 ng de p24 (en 300 l de MDM medios de comunicación) de NL4.3Bal virus env en la apropiada pozos; añadir sólo medio MDM en los pocillos de control . Incubar 2 horas a 37 ° C en un 5% Atmósfera de CO 2. Se lavan las células con PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Añadir 600 l de medio fresco por MDM así. Incubar a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. Al día 3, 6, 9 y 12 después del comienzo de la infección viral, la cosecha 200 l de cada sobrenadante, añadiendo 200 ul de medio fresco MDM posteriormente. Mantener los sobrenadantes recogidos a -20 ° C para la cuantificación de los principales del VIH-1 proteína p24 de la cápsida por ELISA tras Fortín et al. 10. 7. La infección de MDM con luciferasa de la codificación ciclo del virus Con el fin de determinar el impacto del parásito sobre el VIH-1 la expresión génica en MDM, añadir, según el esquema descrito en la Figura 1B, 10 ng de p24 (en 300 l de medio MDM) de cualquiera de NL4.3 Luc + Env – R + ( VSV-G), NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) o Luc NL4.3 +ENV – I + virus en los pocillos correspondientes. Incubar 2 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. Se lavan las células con 600 l de PBS libre de endotoxinas 3 veces, agregue el PBS suavemente y aspirar de inmediato. Añadir 600 l de medio fresco por MDM así. Incubar a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera. Retire el medio de la infección 72 horas siguientes y añadir 200 l de tampón de lisis 1X (suministrado con el kit de ensayo de la luciferasa). Que las células lisar a temperatura ambiente con agitación suave. Almacenar a -20 ° C. Descongele la placa y transferir 40 l del lisado a una placa de luminómetro 96-así, añadir 100 l de sustrato de luciferasa (suministrado con el kit de ensayo de luciferasa) y medir la luciferasa (luciferasa de luciérnaga) actividad en un luminómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. 8. Los resultados representativos Utilizando el modelo de co-infección, se muestra que exposure de P. falciparum a MDM disminuye su susceptibilidad a la infección VIH-1. De hecho, una disminución significativa (p <0,05; 2 ANOVA, el día 12) en la liberación de partículas virales, medida por el VIH-1 proteína de la cápside p24 en el sobrenadante, se observa en MDM previamente con parásitos (Figura 2A). Esta observación se confirma en las células infectadas por virus que codifica un gen de la luciferasa-reportero. La infección con los virus de este tipo MDM albergan ya sea exógeno VSV-G o glucoproteínas del VIH-1 lleva a significativamente (p <0,05, t de Student-test) la producción de luciferasa menos en las células expuestas a P. falciparum (Figura 2B). Es de notar que VSV-G-pseudotyped virus producido actividad mucho mayor que sus contrapartes luciferasa JRFLenv; esto es debido a la eficiencia infección mayor de VSV-G partículas pseudotyped 15. Dado que los parásitos la exposición a los impactos MDM ambos tipos de virus, esto sugiere que influye en algún paso en la ex gen viraldepresión (Figura 2B). También es importante mencionar que la viabilidad celular no se vio afectada por la exposición a MDM iRBC (datos no presentados), lo que indica que la inhibición observada es específica y no debido a la mortalidad celular. Figura 1. A) Placa de régimen para la infección con un virus MDM replicativa totalmente Falsa. Células no infectadas. uRBC: las células expuestas a los glóbulos rojos no infectados. iRBC: las células expuestas a Plasmodium falciparum infectados por los glóbulos rojos. Bal: células infectadas con NL4.3Bal env Bal / uRBC:. Las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3Bal env Bal / iRBC:.. Las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3Bal env b) Régimen placa para la infección con MDM solo ciclo de la luciferasa de codificación de virus de la Falsa. células no infectadas. uRBC: las células expuestas a los glóbulos rojos no infectados. iRBC: las células expuestas a Plasmodium falciparum-infected glóbulos rojos. Δenv: células infectadas con NL4.3 Luc + Env – I + JRFL:. Células infectadas con NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env). VSV-G: las células infectadas con NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-G) Δenv / uRBC:.. las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env-R + Δenv / iRBC: las células expuestas a iRBC e infectados con NL4.3 Luc + Env – I + JRFL / uRBC: las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env).. JRFL / iRBC: las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env). vsv-g/uRBC: las células expuestas a uRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-G): vsv-g/iRBC. las células expuestas a iRBC e infectadas con NL4.3 Luc + Env – R + (VSV-G). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> Figura 2. . A) Efecto de Plasmodium falciparum en el VIH-1 en la producción viral MDM MDM fueron expuestos a uRBC o iRBC en una proporción 75:1 (uRBC / iRBC: MDM) durante 4 horas y se lavó extensamente. Las células fueron infectadas con 10 ng de NL4.3Bal p24 durante 2 horas env. La producción viral fue supervisado por ELISA para VIH-1 p24 en el sobrenadante libre de células en diferentes puntos temporales después de la infección viral inicial. Un representante experimento se muestra B) Efecto de Plasmodium falciparum en el VIH-1 de transcripción viral en MDM MDM fueron infectados con uRBC o iRBC en una proporción de 75:1 (uRBC / iRBC:.. MDM). Las células fueron infectadas con 10 ng de p24 del virus de un solo ciclo (ya sea NL4.3 Luc + Env – R +, NL4.3 Luc + Env – R + (JRFL env) o NL4.3 Luc + Env – R + (VSV- g)). Luciferase expresión se evaluó en lisados ​​celulares 72 horas después de la infección inicial del virus. Un experimento representativo se muestra.