복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em>에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의> 재관류<em> lacZ</em> 태그 종양 세포

1.에서 시츄의 폐 관류 및 고정 ~ 150 μl 인산염의 IP 주입하여 마우스를 마취는 생리가 (PBS) 112.5 밀리그램 / kg (체중) 케타민, 16.5 밀리그램 / kg xylazine, 15 밀리그램 / kg acepromazine (또는 적절한 진통제를 포함하는 다른 마취로).를 포함하는 버퍼 마우스 반사 신경이 더 이상 관찰되지 않을 때, 다시 다운 운영 테이블에 문제를 해결 아래로 매끄러운 머리카락에 70 %의 에탄올과 모피 젖었 어. 목으로 복부의 피부를 열고 측면에 당기거나 제거 할 수 있습니다. 충분한 크기로 복막과 가슴을 엽니 다. 이후 재관류의 감소 효율을 피하기 위해 큰 혈관의 파열 (예를 들면 베나의 jugularis) 방지합니다. 간 아래 대정맥 caudalis 잘라. 폐 완전히 흰색이며 때까지 뛰는 심장의 우심실로 천천히 10-15 ML PBS를 주입 24G 바늘 – 21G를 갖춘 20 ML의 주사기를 사용하여마음 (심장 수 축제) 박동을 멈 춥니 다. 혈관 클램프로 간, 횡경막 위의 혈관을 찔러. 오른쪽 심실로 PBS에 3 % paraformaldehyde의 ~ 2 ML (PFA)를 삽입 24G 바늘 – 21G를 갖춘 10 ML의 주사기를 사용합니다. 가슴 이외의 기관을 발견. 폐는 증가 될 때까지 기관에 PBS 두개골 (가슴 이외의)에 3퍼센트 PFA의 ~ 3 ML를 삽입 할 때 동일한 주사기를 사용합니다. 즉시 바늘을 제거 후 혈관 클램프로 펑크의 기관 꼬리를 찔러 및 고정 할 수 있도록 10 분 기다립니다. 혈관 클램프 위의 혈관을 가로로 쪼개다, 클램프를 제거하고 초과 PFA를 제거 할 수 우심실로 ~ 2 ML PBS를 삽입. 찔린 바늘이있는 모든 폐 엽 (叶)의 하단 부분은 기관에서 혈관 클램프를 제거하고의 PFA까지 첫 번째 구멍의 기관 꼬리에 중간 / PBS 1:1 삽입 PolyFreeze의 솔루션 3-5 ML를 삽입 공기가 신선한 빈터엽은 솔루션으로 대체됩니다. 집게로 마음을 당겨와 결합 조직 인대, 혈관 및 기관을 끊어 버렸네하여주의 깊게 폐를 제거합니다. 폐에 연결된 마음을 유지. 폐 조직 분석을 진행하는 방법에 따라 섹션 2 또는 3에 명시된 프로토콜로 진행합니다. 이 두 분석을 수행하려는 경우, 한 폐 엽을 제거하고 3에서 설명 된대로 진행합니다. 이 아래 설명 된대로 마음에 연결된 나머지 엽 (叶)을 처리합니다. 2. 전체 폐 엽 (叶)에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화 단단히 닫는 뚜껑이있는 플라스틱 컵에 폐를 놓고 30-60 분 동안 실온에서 PBS에 2 %의 포름 알데히드로 해결할 수 있습니다. 고정 솔루션을 제거하고 PBS로 철저하게 3 회 씻는다. 갓 5 – 브로 모 -4 – 클로로-3-인돌 릴-β-D-galactoside (X-걸) 착색 솔루션 (X-걸 주식 솔루션 [40 MG / ML에서 조리 적어도 10 ML을 추가Dimethylformamide] 1시 40분 기본 착색 솔루션에 희석, pH를 7.1 (표 1), 빛으로부터 보호). 솔루션에 완전히 유지하고 공기의 교환을 허용하도록 포트에만 느슨하게 뚜껑을 배치 할 수있는 수영 폐의 상단에 거즈 조각을 놔. 빛으로부터 보호 3-5 시간에 37 ° C에서 알을 품다. X-걸 솔루션을 제거 잔류 X-걸 솔루션을 (선택 사항) 제거하고 4% PFA를 추가 할 수 PBS로 한 번 씻어. 3. 폐 Cryosections에 lacZ 태그 전이성 종양 세포의 시각화 undiluted PolyFreeze 퍼가기 매체와 3분의 1에 미리 기입 표시 퍼가기 금형. 상단에있는 폐 엽을 넣고 엽이 완전히 덮여 때까지 매체를 삽입 따라 작성하십시오. 거품을 억제하기 위하여 노력하고 있습니다. 20 분에 4 ° C에 포함 된 폐를 품다. 그런 다음 -80 ° C.에 천천히 드라이 아이스와 이소 펜탄 및 매장의 혼합물에 포함 된 폐를 고정 7-10 μm cryo 잘라그라 이오 스탯에 섹션 및이 SuperFrostPlus 현미경 슬라이드에 올려 탑재합니다. humidified 챔버에서 24 시간에 ° C 37 X-걸의 착색 솔루션을 즉시 절을 품다. 증류수에 잠시 후 5 분에 있고 PBS 2 회에서 슬라이드를 씻어. , 10-30 초에 대한 핵 빠른 붉은 색과 반대 얼룩은 증류수에 씻어 Immu 마운트와 슬라이드를 탑재합니다. 4. 대표 결과 아사이 외. 높은 전이성 LM8 하위 세포 라인에서 파생 된 것과 다른 부모 던 세포에서 파생 된 SC 기본 종양, 저절로에서 감지 폐 ​​metastases를 형성하지 않는 것이 던 – 파생 LM8 OS 마우스 모델에있는 원본 문서에보고 syngeneic C3H 마우스 14. 여기에보고 된 기술을, 우리는 Dunn/LM8 마우스 OS 모델의 metastases의 형성을 reinvestigated. 우리는 안정적인 lacZ-transduced 던과 LM8 셀을 이용했다s와 쥐의 시츄 폐 관류 및 고정을위한 프로토콜. 피하에 주입 쥐 perfused 및 비 perfused 폐의 대표 이미지 lacZ는 – transduced 및 제어 던과 LM8 세포를 그림 1에 표시됩니다 비 transduced. 제어 던 세포를 주입 생쥐에서 매크로 및 미세 metastases은 비 perfused와 perfused 폐 (그림 1A, I-IV)에 탐지가 남아 있었다. 그러나, 흥미롭게도, 던 – lacZ 세포와 함께 주입 마우스에 X-여자의 얼룩은 비 perfused 폐 (그림 1A, 누나)의 표면에 단일 세포 또는 작은 세포 클러스터 (<0.1 mm)의 푸른 micrometastatic foci을 공개했다. 인 폐의 현장 재관류와 고정 더욱 던-lacZ micrometastases (그림 1A, VIII)의 detectability을 개선. 그러나, 매크로 foci로 가지 (그림 1A, V, VII) 관찰되지 않았습니다. <이/ P> 반투명 제어 LM8 세포, 거의 감지 macrometastatic foci로 주입 마우스에 직경 0.1 mm보다 큰이 아닌 perfused 폐 (그림 1B, 난)에서 인정되었다. 폐의 재관류 (그림 1B, III)는 foci의 검출이 향상되지 않았다. 그러나, 쥐에서 여러 LM8-lacZ 세포를 주입 X-걸 스테인드 푸른 매크로 (그림 1B, V)와 micrometastases (그림 1B, 누나)가 아닌 perfused 장기의 표면에 발견되었다. 또한, 폐의 재관류는 추가의 detectability 매크로 및 micrometastases을 (- VIII 그림 1B, VII) 개선. 따라서, 마이크로 및 macrometastases은 주로 인해 장기의 표면 아래에 foci도 보게되었습니다 된 perfused 조직의 투명도에, 높은 밀도 및 더 많은에 표시되었다. 추가 H폐 조직의 cryosections를 사용하여 istological 분석 lacZ-transduced 던과 LM8 세포를 주입 쥐 폐 metastases의 개선 detectability을 확인했습니다. 던 – lacZ 또는 LM8-lacZ 세포에서 파생 된 주요 악성 종양으로 마우스에서 각각의 제어 세포, micrometastases 또는 단일 셀 foci의 주요 악성 종양으로 쥐와 달리 폐 섹션 (그림 2)에서 인정되었다. 또한, macrometastases 또한 제어 LM8 세포 (그림 2C, D)으로 주입 동물보다 LM8-lacZ 세포를 주입 쥐에 더 명확하게 볼 수 있었다. 그림 1.의 자연 metastases의 검색이 아닌 transduced (I-IV)와 lacZ는 – transduced (V-VIII) 던 (A)와 LM8 (B) 비 perfused (I, II, V, VI)와 perfused의 셀 C3H 마우스의 (3, 4, VI​​I, VIII) 폐. 대표 X-걸 – 역에서 Metastasesined 전체 폐 (V, A와 B의 VII)와 각각의 클로즈업 (바이올렛에서 VIII A와 B) 파란색 표시됩니다. 비 태그 LM8 세포 (B에 I-IV)에 주입 쥐 기관의 Macrometastatic foci가 (> 0.1 mm) 별표로 표시됩니다. 클로즈업에 표시된 영역은 전체 폐에 대표입니다. 스케일 바는 전체 폐의 ​​이미지에서 1 mm와 클로즈업의 0.1 mm를 표시합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 2. 던과 폐 cryosections에 LM8 micrometastases의 감지. 10월 임베디드 폐 조직의 섹션은 humidified 챔버에서 24 시간에 37 ° C에서 X-걸의 착색 솔루션에 incubated하고 핵 빠른 빨간색으로 counterstained했다. 화살표 던-lacZ (B) 또는 LM8-lacZ 전지 (D)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 인정 micrometastatic foci를 가리 킵니다. 엠icrometastases가 아닌 transduced 던 (A) 또는 LM8 셀 (C)와 함께 주입 마우스의 폐 섹션에서 탐지가 남아 있었다. 스케일 바는 0.1 mm를 나타냅니다.