Um protocolo para a preparação de robusta, extratos de pequena escala HeLa nucleares é descrito. Este protocolo é valiosa para os ensaios que requerem o uso de pequenas populações de células, tais como as células tratadas com fármacos ou RNAi. O método deve ser aplicável a uma ampla variedade de ensaios de expressão génica e outros tipos celulares, incluindo células do paciente.
Uma grande quantidade de progresso da expressão do gene compreensão foi feita utilizando sistemas in vitro. Para a maioria dos estudos, ensaios funcionais são realizadas utilizando extractos que são preparados em grandes quantidades a partir de 10-50 ou mais litros de células cultivadas em suspensão. No entanto, estas preparações em grande escala não são passíveis de se rapidamente a testar os efeitos in vitro que resultam de uma variedade de tratamentos celulares in vivo ou condições. Este artigo de vídeo revista mostra um método para a preparação funcionais em pequena escala extractos nucleares, utilizando células HeLa como um exemplo. Este método é realizado utilizando apenas três placas 150 mm de células cultivadas em monocamadas aderentes. Para ilustrar a eficácia dos extractos de pequena escala, mostramos que eles são tão activo como a granel extractos nucleares para acoplados a RNA polimerase II de transcrição / splicing reacções. Para demonstrar a utilidade do protocolo extracto, mostramos que splicing é abolida em extractos preparados a partir de células HeLas tratados com o inibidor de splicing droga E7107. O protocolo de pequena escala devem ser geralmente aplicável a qualquer processo ou tipo de célula que podem ser investigado in vitro utilizando extractos celulares. Estes incluem células do paciente que só estão disponíveis em quantidades limitadas ou células expostas a inúmeros agentes como as drogas, agentes de danificar o DNA, RNAi, ou transfecção, que requerem o uso de populações de células pequenas. Além disso, pequenas quantidades de células cultivadas de fresco são convenientes e / ou necessários para algumas aplicações.
Nós estabelecemos um método rápido e reprodutível para a preparação de extractos nucleares a partir de pequenas quantidades de células HeLa cultivadas em monocamadas. Nós demonstramos que estes extractos são robustos, mostrando que a cinética e da eficiência de RNAP II de transcrição / splicing ensaios são semelhantes nos extractos de pequena escala e grandes quantidades nucleares. Nós mostramos a utilidade dos extractos, demonstrando que os extractos preparados a partir de células tratadas com um fármaco inibidor de splicing são activos para a transcrição mas defeituoso em splicing.
O nosso método para a preparação em pequena escala extractos nucleares foi estabelecida por combinação e optimização dos métodos previamente estabelecidos para a tomada de extractos de células HeLa cultivadas em suspensão em grande escala 1,8 e um método para a pequena preparação de extractos 9. Nós estabelecemos nosso protocolo porque os anteriores em pequena escala extractos não eram funcionais para alguns ensaios, tais como a transcrição acoplado / splicing ensaio. Uma diferença importante entre o anterior em pequena escala protocolo 9 e nossa é que nós otimizamos as condições para a lise de células usando uma mini-Dounce enquanto que o protocolo anterior lisadas células, empurrando-os através de uma pequena agulha de calibre 9. Os resultados agulha de lise-em bolhas, que podem explicar por que os extratos foram inativos e / ou difíceis de reproduzir para alguns ensaios. Nós também adicionamos um patamar de concentração ao nosso protocolo. Este passo aumenta a actividade dos extractos, que são extremamente sensíveis a concentração, e também limita a variabilidade entre extractos que é inerente à pequena escala preparações. Finalmente, a nossa preparação é rotineiramente realizados com apenas três placas 150 mm de monocamada de células, sem qualquer efeito significativo sobre a actividade em comparação com extractos granel. Assim, o procedimento é prontamente favorável para as preparações em pequena escala que requerem reagentes dispendiosos ou disponibilidade de células limitada. Por exemplo, nós preparamos small escala extratos de células knockdown de RNAi e de leucemia linfocítica crónica (LLC células) do paciente, e usou esses extratos para testes funcionais e / ou bioquímicos (EGF, JLH, TY e RR, inédito). Verificou-se que os extractos são valiosos para RNAi seguido por ensaios bioquímicos específicos, tais como immunopreciptations, westerns, e coloração com prata. Depois de estabelecer a eficácia de derrubando uma proteína particular, um estudo mais detalhado pode ser realizada fazendo uma knockdown estável de linha de células, o que pode ser usado para preparar extractos adicionais a baixo custo. Espectrometria de massa de proteínas presentes em imunoprecipitados obtida a partir destas linhas celulares knockdown será também uma aplicação útil do método. Além do ensaio acoplado transcrição / splicing que foi utilizado como um exemplo para a nossa descrição protocolo aqui, os extractos de pequena escala devem ser geralmente aplicável a vários ensaios funcionais e bioquímicas, tais como os utilizados para a r diferenteeps na expressão do gene (por exemplo, nivelamento, splicing, transcrição, processamento de poliadenilação microRNA,). O protocolo pode também ser adaptado para tipos de células do paciente, que pode ser obtida em suspensão (tal como as células CLL) ou cultivadas em cultura (tais como fibroblastos de pacientes). Finalmente, a fracção citoplasmática obtido durante o procedimento deve ser úteis para ensaios funcionais e bioquímicas que exigem que o citoplasma.
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a E. M. Ibrahim Winkelbauer-Hurt,, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng para discussões úteis. As células HeLa foram obtidos a partir do National Cultura Celular Center (Minneapolis, MN). Agradecemos também a Eisai Co., Ltd para fornecer E7107 ea Nikon Imaging Center da Harvard Medical School de ajuda com microscopia de luz. Este trabalho foi financiado por uma concessão de NIH GM043375 para RR e EGF e companheirismo NRSA para JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.