פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.
העסקה הגדולה של התקדמות ביטוי גנים הבנה נעשה שימוש במערכות חוץ גופית. עבור רוב המחקרים, מבחני תפקודית מתבצעות באמצעות תמציות כי הם מוכנים בכמויות גדולות מ 10-50 או יותר ליטרים של התאים הגדלים ההשעיה. עם זאת, אלה בקנה מידה גדול ההכנות אינן ניתנות במהירות לבדיקת אפקטים חוץ גופית הנגרמות כתוצאה ממגוון רחב של טיפולים הסלולר או תנאים vivo. מאמר זה מציג את יומן הווידאו שיטה להכנת תפקודית בקנה מידה קטן תמציות גרעיני, באמצעות תאים הלה כדוגמה. שיטה זו מתבצעת באמצעות כמה כמו 3 150 מ"מ לוחות של תאים שגודלו כמו monolayers חסיד. כדי להמחיש את יעילות בקנה מידה קטן תמציות, אנו מראים כי הם פעילים כמו תמצית גרעיני בכמות גדולה עבור מצמידים RNA פולימראז II שעתוק / שחבור תגובות. כדי להדגים את התועלת של פרוטוקול תמצית, אנו מראים כי שחבור הוא בוטל ב תמציות מוכנות מתא הלהשל מטופלים עם התרופה מעכב שחבור E7107. פרוטוקול בקנה מידה קטן צריך להיות רלוונטי, בדרך כלל, תהליך או סוג התא יכול להיחקר במבחנה באמצעות תמציות סלולריים. אלה כוללים את התאים החולים, כי הם זמינים רק בכמויות מוגבלות או תאים שנחשפו סוכנים רבים כגון תרופות, סוכני ה-DNA, פגיעה, או RNAi transfection, אשר דורשים את השימוש של אוכלוסיות תאים קטנים. בנוסף, כמויות קטנות של תאים בוגרים טריים נוחות ו / או נדרש עבור יישומים מסוימים.
הקמנו שיטה מהירה לשחזור להכנת תמציות גרעיני של כמויות קטנות של תאים הלה גדל כמו monolayers. הראינו כי תמציות אלה הם חזקים ידי מראה כי קינטיקה והיעילות של RNAP השנייה שעתוק / שחבור מבחני דומים תמציות גרעיני בקנה מידה קטן ולא בתפזורת. הראינו את התועלת של תמציות על ידי הוכחת כי תמציות שהוכנו מתאי שטופלו בתרופה מעכב פעילות של שחבור שעתוק אבל פגום שחבור.
השיטה שלנו להכנת בקנה מידה קטן תמציות גרעיני הוקמה על ידי שילוב וייעול שיטות שנקבעו בעבר להכנת תמציות מתאי הלה הגדלים להשעיה בקנה מידה גדול 1,8 ואת שיטת הכנה בקנה מידה קטן של תמציות 9. הקמנו פרוטוקול שלנו, כי את הקודמות בקנה מידה קטן תמציות לא פונקציונלי מבחני מסוימים, כגון שעתוק יחד / splicing assay. הבדל חשוב בין הקודמת בקנה מידה קטן פרוטוקול 9 ושלנו היא שאנחנו מותאם התנאים lysing תאים באמצעות dounce מיני ואילו בפרוטוקול הקודם lysed תאים על ידי לחיצה עליהם באמצעות מחט קטנה בקוטר 9. את המחט, תמוגה תוצאות בועות, מה שיכול להסביר מדוע תמציות היו פעילים ו / או קשה לשחזר את מבחני מסוימים. כמו כן הוסיף צעד ריכוז לפרוטוקול שלנו. צעד זה מגדיל את הפעילות של תמציות, אשר רגישים במיוחד הריכוז, וגם מגביל את השונות בין תמציות שהוא חלק קטן בקנה מידה ההכנות. לבסוף, ההכנה שלנו מתבצעת באופן שגרתי עם רק שלוש צלחות 150 מ"מ של תאים monolayer, ללא כל השפעה משמעותית על הפעילות לעומת תמציות בתפזורת. לפיכך, הנוהל אינו מקובל בקלות על בקנה מידה קטן ההכנות הדורשים ריאגנטים יקרים או מקום פנוי בתא מוגבלת. לדוגמה, הכנו SMALL בקנה מידה תמציות מתאי RNAi מציאה ומ לימפוציטית כרונית (CLL) בתאי לוקמיה החולה, שימוש בתמציות אלה מבחני תפקודית ו / או ביוכימי (EGF, JLH, טאי ו RR, לא פורסם). מצאנו כי תמציות הם בעלי ערך עבור RNAi ואחריו מבחני ביוכימיים ספציפיים, כגון immunopreciptations, מערבון, וכן צביעה כסף. לאחר הקמת היעילות של דריסה חלבון מסוים, מחקר מפורט יותר ניתן לבצע על ידי ביצוע מציאה יציבה התא קו, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להכין תמציות נוספות בעלות נמוכה יותר. ספקטרומטריית מסה של חלבונים הנמצאים immunoprecipitates לקבל את שורות תאים מציאה יהיה גם יישום שימושי של השיטה. בנוסף assay שעתוק / שחבור יחד כי היינו כדוגמה לתיאור הפרוטוקול שלנו כאן, בקנה מידה קטן תמציות צריך להיות רלוונטי בדרך כלל מבחני פונקציונלי ביוכימיים רבים, כגון אלו המשמשים רחוב אחרEPS של ביטוי גנים (למשל מכסת, שחבור שעתוק, polyadenylation, עיבוד microRNA). פרוטוקול יכול גם להיות מותאם עבור סוגי תאים חולים, כי ניתן להשיג גם ב ההשעיה (כגון תאים CLL) או גדל בתרבות (כגון fibroblasts המטופל). לבסוף, חלק cytoplasmic לקבל במהלך ההליך צריך להיות שימושי עבור מבחני גם פונקציונלית ביוכימי הדורשים הציטופלסמה.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Winkelbauer מ-הארט, א איברהים, פ ולנסיה, ק Dufu, ה 'נג לדיונים מועילים. תאים הלה התקבלו התרבות הלאומית Cell מרכז (מיניאפוליס, מינסוטה). כמו כן, אנו מודים Eisai Co, Ltd למתן E7107 ו דימות Nikon מרכז בבית הספר לרפואה בהרווארד לעזרה עם מיקרוסקופ אור. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM043375 כדי RR ו EGF ו NRSA העמיתים JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.