Non plasmatici Incollaggio di PDMS Economico per la Fabbricazione di dispositivi microfluidici

Preparazione dei dispositivi Microfluidic per colture cellulari Neuron 1) Pulire Corning No.1 24 mm X 40 diapositive mm di vetro Sonicare i vetrini in un sonicatore bagnomaria per 30 minuti Sciacquare i vetrini con il 70% EtOH Lavare i vetrini tre volte con dH 2 O Diapositive a secco in una cappa di coltura per alcune ore, preferibilmente durante la notte Nota: Abbiamo vassoi di metallo speciale che si carica con le diapositive. I vetrini sono separati individualmente e messi in slot in questo rack di metallo. Possiamo quindi posizionare questi vassoi di metallo di carico in un piatto di vetro che si riempiono di acqua, posto nel bagno sonicatore acqua e ultrasuoni per 30 minuti. Lavaggi successivi si svolgono in questo piatto. 2) Preparazione dei dispositivi PDMS Tagliare lo stampo PDMS dal wafer di silicio, buchi nel cast PDSM e quarto lo Pulire i dispositivi di PDMS in primo luogo che soffia gas inerte (argon o azoto) attraverso di loro. Quindi utilizzare Marca 3M Scotch 471 nastro per sollevare i detriti rimanenti Nota: è importante mantenere i dispositivi a faccia in su. Inizialmente, quando abbiamo tagliato il PDMS lontano dal wafer di silicio, lato a contatto con l'ostia è il lato pulito: contiene i canali microfluidica. Cerchiamo di essere attenti come siamo in grado di non danneggiare il dispositivo, e mantenere la faccia pulita verso l'alto finché non siamo pronti per l'incollaggio di plasma. Dispositivi di autoclave in contenitori di plastica Dopo la sterilizzazione in autoclave, pulita n. 1 vetrini Corning e plasma-treat dispositivi utilizzando un detergente marchio Harrick plasma, www.harrickplasma.com Posizionare i dispositivi puliti lato negativo sul vetrino. Il dispositivo è ora al plasma legato al vetrino. 3) Rivestimento Periferiche con poli L-lisina (PLL) PLL è aggiunto a un bene su ogni lato del dispositivo e ha permesso di fluire attraverso nel pozzo prossimo => 150 ml di PLL per i pozzi di grandi dimensioni e 30 μ l PLL per i pozzi più piccoli. Non ha, per l'esattezza fino a quando i pozzi sono pieni. Nota: Se si guarda un dispositivo vedrete 4 pozzi: ogni due sono collegati. Volete mettere il PLL in un pozzo in modo che il flusso attraverso il dispositivo nel pozzo successivo. Lasciare che il PLL a fluire attraverso il dispositivo per circa 10 minuti e poi aggiungere più PLL per i pozzi di riempirle Posizionare i dispositivi contenenti PLL in un incubatore a 37 ° C per un minimo di 4 ore (durante la notte è preferibile) Vuoto fuori l'eccesso PLL dopo il trattamento, ma attenzione a non aspirare tutto il liquido dal dispositivo Nota: Se non si desidera introdurre bolle d'aria ai canali o da camera. Solo il vuoto in eccesso PLL nei pozzetti. Aggiungi autoclave dH 2 O ad ogni bene su entrambi i lati del dispositivo, e permette di scorrere alla ben altro per azione capillare La figura 1 è un diagramma di un dispositivo a microfluidi. Notate come il Blue (Soma lato) è collegata e il Rosso (lato assonale) sono collegati. Quando si dice mettere il PLL, o l'acqua o del supporto, su un bene su ogni lato del dispositivo, che cosa si intende, ad esempio, è: Place 150 ul di autoclave dH 2 O in un blu Ebbene posto 150 ml di dH autoclavato 2 0 in un unico Rosso Bene. L'acqua (o PLL, o Media o Celle) fluirà attraverso il dispositivo alla ben altri corrispondenti. Figura 1 Nota: Si prega di notare che, d'ora in poi, quando dico "media luogo, le cellule, l'acqua o PLL nella TOP pozzi", mi riferisco allo schema di sopra, dove il Soma sarebbe a sinistra e gli assoni crescerà al a destra. Aspirare l'acqua (ancora una volta facendo attenzione a non rimuovere completamente tutto il liquido dal dispositivo), quindi aggiungere altri 150 ml di autoclave dH 2 O a uno dei collegati ogni bene e permettono di fluire attraverso i corrispondenti bene. Posizionare il dispositivo contenente dH 2 O in un incubatore a 37 ° C per 1 ora, quindi ripetere la fase di lavaggio di nuovo. Lavare i dispositivi di tre volte con dH 2 O per un'ora ciascuno, che è il totale. Nota: A causa della possibilità che borato dal PLL in grado di assorbire in PDMS, alcuni nel laboratorio di Jeon consigliamo incubando i dispositivi di una notte con autoclave dH 2 O dopo un paio di initial risciacqui veloce. Questo farà sì che tutte le borato libero arbitrio leach fuori del PDMS prima del carico delle cellule. Se questo non viene fatto, ci può essere un rilascio di borato nei media nel corso del tempo, che potrebbe portare a citotossicità. Aggiungi neurali media basale (NBM) con i fattori necessari (glutamax, B27, PenStrep) per i pozzi in alto Nota: I dispositivi possono essere incubato per una notte e placcato con le cellule il giorno dopo, o incubate un minimo di 3 ore con NMB fattori + prima placcatura le cellule. Preparare i neuroni da caricare nel Dispositivi Utilizziamo 18 giorni corteccia vecchio ratto fetale che ci sia acquistare da una società denominata Bit cervello o che è preparato qui nel campus per noi. Noi preferiamo per ottenere il tessuto fresco. Ottenere 1 corteccia cerebrale del feto (2 pezzi di tessuto) conservati in Hibernate E Prendete 3 pipette di vetro lunghe e fuoco ogni loro in dimensioni sempre più piccoli utilizzando una lampada ad alcool rimuovere i tessuti da Hibernate E con una pipetta di vetro e posto in 2 ml di NMB Fattori + in un tubo sterile 15 ml. Triturazione: Usando una pipetta di vetro a bulbo e la corteccia viene passato su e giù per circa 5 a 10 volte. Poi, la pipetta prossimo più piccolo viene usato per pipetta su e giù per il tessuto. Infine, la più piccola pipetta viene usato per pipetta su e giù per il tessuto. Ci piace fare in modo che non ci siano pezzi visibili. Nota: Recentemente, il Laboratorio Jeon ha iniziato a confronto le cellule dal tessuto conservati in Hibernate e alle cellule che sono stati preparati da tessuto inizialmente trattati con tripsina 0,125% nel 50% Ca + + libero e Mg + + libero buffer di dissezione. Il consenso è che il tessuto preparato con tripsina resa cellule più vitali rispetto al tessuto messo inizialmente in Hibernate E. Se non si ha intenzione di utilizzare il tessuto subito, allora avete bisogno di conservare il tessuto in Hibernate E. Se avete intenzione di utilizzare il tessuto subito e vorrei vitalità maggiore, poi trattare il tessuto con tripsina prima della triturazione meccanica come segue: 1) diluire 1 ml 0,25% tripsina (Gibco, Invitrogen) con 1 ml di Ca + + libero Mg + + gratis buffer di dissezione (finale tripsina = 0,125%) in una provetta da 15 ml (mantenere freddo ghiaccio), 2) tessuto posto nel buffer e incubare immediatamente a 37 ° C per 8 minuti, 3) aggiungere 10 ml DMEM/10% FBS per fermare il tripsina reazione e continuare il protocollo di seguito. Cellule Centrifugare a 1100 rpm per 1 minuto Mezzi di comunicazione aspirato accuratamente fuori il pellet Aggiungere 1 ml di NMB fattori + al pellet e ri-sospesa pipettando su e giù Passare il risospese cellule flusso per gravità attraverso un filtro per eliminare eventuali grumi (BD Falcon cellula filtro di nylon 40 um) Conte e la piastra di cellule: In una provetta per microcentrifuga, aggiungere 60 microlitri NMB + fattori, 20 l di sospensione cellulare, e 20 ml di blu tripano poi mescolare Aggiungere circa 10 ml di questa soluzione in un emocitometro e contare le cellule vive (non blu) Regolare la concentrazione di 2,5-4,5 x10 6 cellule / ml Nota: In genere ottiene una concentrazione di circa 2,5-4,5 x 106 cellule / ml. a seconda del volume le cellule sono risospese in (di solito da 1 ml + B27/Glutamax/PenStrep percortex NBM). Se il tessuto è stato preparato con tripsina, la resa sarà probabilmente aumentato. La placcatura Dispositivi Celle di carico (neuroni primari) in un pozzetto del dispositivo Tavola 5 microlitri per dispositivo piccolo e 20 l per dispositivo grande Nota: è possibile carico 10 l di cellule sulla parte superiore del dispositivo e 10 microlitri sul fondo del dispositivo (la metà del volume totale), oppure direttamente tutti i 20 l di cellule nel ben superiore cromosomiche (5 microlitri nel cromosomiche alto ben per i dispositivi di piccole dimensioni). Incubare per 10 minuti a 37 ° C in modo da incubatore cellule possono cominciare a collegare Aggiungi microlitri circa 150/30 di fattori + NMB in ciascun pozzetto a seconda delle dimensioni dispositivo Nota: I volumi possono variare a seconda dello spessore del PDMS. Tutto ciò che importa è che i pozzi sono pieni. Supplementare Uso le periferiche senza Plasma Incollaggio Senza il trattamento al plasma, Christina Tu, un tecnico, che lo fa con successo ogni settimana senza plasma, dice a caricare solo le cellule subito. Ricordarsi di rimuovere il supporto da entrambi i pozzetti sul lato soma (lato assone non importa se si lascia la media). E 'il flusso del fluido che permette alle cellule di entrare nel canale principale. Se si dispone di mezzi di comunicazione nei pozzi, non sarà possibile ottenere il flusso del fluido.