Análise Quantitativa de Fitness (QFA) é uma série complementar de métodos experimentais e computacionais para estimar as aptidões cultura microbiana. QFA estima o efeito de mutações genéticas, drogas ou outros tratamentos aplicados sobre o crescimento micróbio. Experimentos de escala a partir da análise focalizada de uma única cultura a milhares de culturas paralelas podem ser projetados.
Análise Quantitativa de Fitness (QFA) é um fluxo de trabalho experimental e computacional para comparar as aptidões de culturas microbianas cultivadas em 1,2,3,4 paralelo. QFA pode ser aplicado a observações orientadas de culturas individuais, mas é mais útil para genoma interacção genética ou telas de drogas investigar até milhares de culturas independentes. O método central experimental é a inoculação de independentes, diluir líquidos culturas microbianas em placas de agar sólidos que são incubadas e regularmente fotografadas. Fotografias de cada ponto do tempo são analisados, produzindo estimativas quantitativas de células de densidade, que são utilizados para construir curvas de crescimento, permitindo que as medidas quantitativas aptidão para ser derivado. Aptidões de cultura podem ser comparados para quantificar e classificar forças de interacção genética ou sensibilidades de drogas. O efeito sobre a aptidão da cultura de quaisquer tratamentos adicionados em agar de substrato (por exemplo, moléculas pequenas, antibióticos ou nutrientes) ou aplicadas a placas de externoly (por exemplo, irradiação UV, temperatura) pode ser quantificado por QFA.
O fluxo de trabalho QFA produz taxa de crescimento estima análoga aos obtidos por medição espectrofotométrica da paralelas culturas líquidas em leitores de placas de 96 poços ou de 200 poços. Importante, QFA tem rendimento significativamente superior em comparação com esses métodos. Culturas QFA crescer sobre uma superfície de agar sólido e são, portanto, bem arejadas durante o crescimento sem a necessidade de agitação ou agitação.
Rendimento QFA não é tão alto quanto o de alguns matriz genético sintético (SGA) métodos de triagem 5,6. No entanto, uma vez que as culturas QFA são fortemente diluído antes de ser inoculadas em ágar, QFA pode capturar as curvas de crescimento mais completos, incluindo exponencial e fases de saturação 3. Por exemplo, as observações da curva de crescimento permitir tempos de duplicação de cultura a ser estimado directamente com alta precisão, como discutido anteriormente 1.
Aqui apresentamos umaespecífica QFA protocolo aplicado a milhares de S. cerevisiae culturas que são automaticamente tratados por robôs durante a incubação a inoculação, e de imagem. Qualquer um destes passos automatizados pode ser substituído por um procedimento, o equivalente manual, com uma redução na taxa de transferência associada, e também apresenta um protocolo manual inferior de transferência. As mesmas ferramentas de software QFA pode ser aplicado a imagens capturadas em qualquer fluxo de trabalho.
Temos uma vasta experiência QFA aplicando às culturas da levedura de brotamento S. cerevisiae, mas esperamos que QFA provará igualmente útil para examinar as culturas da levedura S. pombe e as culturas bacterianas.
QFA é em muitos sentidos, um descendente directo de três estabelecidas bancada em escala de técnicas microbiológicas: cultura de diluição testes da série 9 no local, a determinação da curva de crescimento em culturas líquidas gasosas 9 e revestimento réplica 13. Estes três métodos são resumidos e comparados com QFA e outras técnicas de alto rendimento na Tabela 2. Considerando que os ensaios de diluição no local da série definir aptidão uma estirpe como a sua capacidade para formar colónias em uma série de culturas crescidas a partir de uma gama de diluições de inóculo, QFA aptidão estirpe medidas por observações repetidas de uma única cultura para construir uma curva de crescimento. A quantificação aptidão a partir de culturas única permite muitas estirpes mais a ser examinados simultaneamente, sob condições idênticas. Replicando matrizes de culturas permite testes repetidos de coleções de tensão, mais útil ao testar as diferenças de cultura de fitness em ambientes diferentes ou fundos genéticos. O protocolo apresentado QFAaqui usa equipamento caro robótico para replicar, inocular, incubar e placas de agar de imagem, apropriado para a observação de crescimento de milhares de culturas independentes (QFA robótico, Tabela 2). No entanto, desde QFA baseia-se na estabelecidas, técnicas de laboratório tradicionais, pode também ser efectuada muito mais barato, substituindo assistência robô com passos manuais (Manual QFA, Tabela 2). Manual do QFA envolve replicação e inoculação de culturas em ágar usando uma ferramenta de pino manual e transferência manual de placas de e para uma incubadora para a fotografia. O fluxo de trabalho mesma análise computacional pode ser aplicado para gerar curvas de crescimento a partir de qualquer desenho experimental.
Estimativas QFA aptidão parecem ser relativamente preciso. Na Figura 4, as aptidões médios de quatro exemplo, agregados de funcionalmente deleções de genes relacionados são realçados. A proximidade de membros de cada classe de genes funcionalmente relacionados em duas inderentes origens genéticas (ura3Δ e CDC13-1) indica a reprodutibilidade das estimativas QFA fitness. Por exemplo, apenas 3 a deleção do gene (de um 4.300 possível) separar os três membros do complexo MRX conservada.
Alto rendimento alternativas para QFA para testar as características de crescimento de estirpes microbianas incluem PIG 5,6, telas de concorrência em bibliotecas de código de barras 11,12 e telas de captura cinética de densidade óptica em leitores espectrofotométricos placa 10, que estão resumidos na Tabela 2 e descrito mais completamente em outro lugar 8 . QFA e placas de PIG, onde as culturas crescem em superfícies sólidas de ágar (ágar métodos baseados, Tabela 2) pode ser tratada de forma rápida e fácil pelo robô. Culturas de superfície sólida de agar são bem arejadas todo o crescimento e as células podem crescer em culturas fixas, permitindo que os micróbios sociáveis a crescer em uma comunidade 14. Deixado intacto, comunidades microbianas umffect suas próprias micro-ambientes, toxinas secretoras, tais como etanol, e possivelmente de sinalização entre as células. No entanto, contínua mistura de culturas líquidas, necessárias para alcançar aeração adequada, artificialmente perturba comunidades microbianas e os seus micro-ambientes que possam afetar seus modos de crescimento. A contaminação cruzada é uma preocupação menor em métodos de ágar sólido uma vez que há menos oportunidades para líquidos salpicados transportando células entre as culturas. Se ocorrer contaminação por estrangeiros transportados pelo ar micróbios em ensaios de agar sólidos, que muitas vezes podem ser detectado por inspecção visual das placas de agar sólido e representaram ou removido.
Rendimento QFA é significativamente mais elevada do que a de paralelas métodos líquidos de duas maneiras. Primeiro de tudo, no QFA (e SGA) placas, culturas inoculadas são embalados em conjunto de forma mais densa, dando culturas mais independentes por placa. Em QFA existem normalmente 308 culturas, não contando com culturas não experimentais de ponta (Figura 1) COMcomparação em paralelo culturas líquidas com 96 ou 100 culturas por placa. Em segundo lugar, as experiências QFA pode ser dimensionada para um número muito maior de pratos. Considerando que o número de placas analisados numa experiência QFA único é limitada apenas pelo espaço disponível na sala de incubadora ou quente, a frequência de captura de imagem e mínima permitida a frequência de captura máxima alcançável, o número de placas em uma experiência de crescimento líquido é fortemente limitada pela capacidade do leitor de placas (tipicamente um ou dois pratos), ou do empilhador ligado ao leitor de placas (tipicamente 25-50 placas). Recentemente, realizou uma experiência totalmente automatizado QFA em 123 placas, cada uma com 308 culturas experimentais, dando 37,884 culturas simultâneas. Nós estimamos que o número máximo possível de culturas independentes que crescem em líquido é 96 (culturas / placa) x 50 (placas / empilhador) = 4800, que é de cerca de dez vezes menor do que o nosso rendimento QFA. Uma alternativa para as telas de cultura líquido é utilizar muitos automatizado grodispositivos wth em paralelo (Tabela 1 a partir da revisão por Blomberg 8), cada um tendo uma capacidade de um ou dois pratos. Controle de temperatura em cada dispositivo é independente, e assim as condições não são idênticas, mas assumindo que eles são, este fluxo de trabalho exigiria pelo menos 190 desses dispositivos para combinar QFA rendimento (assumindo 200 culturas líquidas por dispositivo).
Em resumo, QFA é um fluxo de trabalho de alta qualidade que podem ser utilmente aplicadas para reunir fenótipos quantitativos de crescimento em ambos os experimentos de pequena escala e centraram-se alto rendimento telas. É flexível o suficiente para ser aplicado de forma eficaz com diferentes requisitos para o equipamento robótico. O componente computacional do fluxo de trabalho QFA baseia-se livremente disponível código fonte, aberto.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos os membros de nosso laboratório e do Centro de Biologia do Sistema Integrado de Envelhecimento e Nutrição (CISBAN) para apoio e discussões úteis. Este estudo foi apoiado pelo Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) e do Wellcome Trust (075294, 093088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.