Analyse quantitative de remise en forme (QFA) est une série complémentaire de méthodes expérimentales et de calcul pour estimer fitnesses cultures microbiennes. QFA estime l'effet de mutations génétiques, les médicaments ou autres traitements appliqués sur la croissance des microbes. Mise à l'échelle des expériences de l'analyse ciblée des cultures en un seul à des milliers de cultures parallèles peuvent être conçus.
Analyse quantitative de remise en forme (QFA) est un flux de travail expérimental et de calcul pour comparer fitnesses de cultures microbiennes cultivées en 1,2,3,4 parallèle. QFA peut être appliquée à des observations ciblées de cultures en un seul, mais est très utile pour l'ensemble du génome d'interaction génétique ou de dépistage de drogues de l'enquête jusqu'à des milliers de cultures indépendantes. La méthode expérimentale centrale est l'inoculation des indépendants, diluer le liquide cultures microbiennes sur des plaques d'agar solides qui sont incubés et régulièrement photographié. Photographies de chaque point dans le temps sont analysés, la production des estimations quantitatives de densité de cellules, qui sont utilisés pour construire des courbes de croissance, ce qui permet des mesures de remise en forme quantitatifs pour être dérivée. Fitnesses Culture peut être comparé à quantifier et de classer les forces d'interaction génétiques ou sensibilités aux médicaments. L'effet sur l'aptitude de la culture de tous les traitements ajouté dans la gélose substrat (par exemple les petites molécules, des antibiotiques ou des nutriments) ou appliqués sur des plaques externesment (par exemple l'irradiation UV, température) peut être quantifiée par QFA.
Le flux de travail QFA produit le taux de croissance les estimations analogues à ceux obtenus par mesure spectrophotométrique de parallèles cultures liquides dans les lecteurs de plaques à 96 puits ou 200 puits. Il est important, QFA a un débit nettement plus élevé par rapport à ces méthodes. Cultures QFA croître sur une surface de la gélose solide et sont donc bien aéré pendant la croissance sans la nécessité d'agitation ou secousses.
Débit QFA n'est pas aussi élevé que celui de certains antenne synthétique génétique (SGA) les méthodes de dépistage 5,6. Cependant, puisque les cultures QFA sont fortement dilués avant d'être ensemencé sur une gélose, QFA peut capturer des courbes de croissance plus complètes, y compris les phases de saturation exponentielle et 3. Par exemple, les observations des courbes de croissance permettent des temps de doublement de la culture à estimer directement avec une grande précision, tel que discuté précédemment 1.
Nous présentons ici unespécifique QFA protocole appliqué à des milliers de S. cultures cerevisiae qui sont automatiquement gérés par des robots lors de l'inoculation, l'incubation et l'imagerie. N'importe laquelle de ces étapes automatisées peuvent être remplacés par un équivalent, une procédure manuelle, avec une réduction du débit associé, et nous présentons également un protocole inférieure débit manuel. Les mêmes outils logiciels QFA peut être appliqué aux images capturées dans les deux flux de travail.
Nous avons une vaste expérience application QFA à des cultures de la levure bourgeonnante S. cerevisiae, mais nous nous attendons à ce que QFA va se révéler tout aussi utile pour examiner les cultures de la levure à fission S. pombe et des cultures bactériennes.
QFA est à bien des égards un lien direct descendant de trois établis l'échelle du laboratoire des techniques microbiologiques: la culture des tests de dilution de la série 9, place de détermination courbe de croissance dans des cultures liquides aérés 9 et placage réplique 13. Ces trois méthodes sont résumés et comparés avec QFA et d'autres techniques à haut débit dans le tableau 2. Alors que les tests de dilution de la série comptant définir de remise en forme d'une souche que sa capacité à former des colonies dans une série de cultures cultivées à partir d'une gamme de dilutions d'inoculum, de remise en forme QFA souche mesures par des observations répétées d'une culture unique pour construire une courbe de croissance. Quantification de remise en forme à partir de cultures en un seul permet de nombreuses souches plus à être examinés simultanément, dans des conditions identiques. Réplication des tableaux de cultures permet des tests répétés de collections de souches, la plupart utilement lors de l'essai pour les différences de conditionnement physique de la culture dans différents environnements ou antécédents génétiques. Le protocole présenté QFAutilise ici coûteux équipement robotique pour reproduire, ensemencer, incuber et des plaques d'agar d'image, approprié pour observer la croissance des milliers de cultures indépendantes (robotique QFA, tableau 2). Cependant, depuis QFA est basé sur des techniques de laboratoire établies, traditionnels, il peut également être réalisée beaucoup plus cher en remplaçant l'aide de robot avec des étapes manuelles (manuel QFA, tableau 2). Manuel QFA implique la réplication et l'inoculation des cultures sur des plaques de gélose en utilisant un outil de broche manuel et le transfert manuel des plaques vers et à partir d'un incubateur pour la photographie. Le flux de travail même analyse computationnelle peut être appliquée pour générer des courbes de croissance de soit la conception expérimentale.
QFA estimations de conditionnement physique semblent être relativement précis. Dans la figure 4, les fitnesses moyennes de quatre grappes par exemple de la délétion de gènes fonctionnellement liés sont mis en évidence. La proximité des membres de chaque classe fonctionnellement lié au gène de dans deux indépendancehorizons différents (génétiques ura3Δ et CDC13-1) indique la reproductibilité des estimations de remise en forme QFA. Par exemple, seulement 3 délétions de gènes (sur un 4300 possible) séparer les trois membres du complexe MRX conservée.
À haut débit alternatives à QFA pour l'essai des caractéristiques de croissance des souches microbiennes comprennent SGA 5,6, écrans de la concurrence dans les bibliothèques à code-barres et des écrans de saisie 11,12 cinétique de densité optique dans les lecteurs de plaques spectrophotométriques 10, qui sont résumées dans le tableau 2 et décrits plus en détail ailleurs 8 . QFA et les plaques SGA, où les cultures se développent sur des surfaces de gélose solide (gélose des méthodes basées sur, tableau 2) peuvent être traitées rapidement et facilement par un robot. Solides cultures de surface de gélose sont bien aérées long de la croissance et les cellules peuvent croître dans les cultures fixes, permettant microbes sociables à grandir dans une communauté 14. Laissée intacte, les communautés microbiennes quelquesffect leurs propres micro-environnements, sécrétant des toxines comme l'éthanol, et éventuellement de signalisation entre les cellules. Cependant, continue le mélange des cultures liquides, nécessaires pour atteindre une aération adéquate, artificiellement perturbe les communautés microbiennes et leurs micro-environnements qui peuvent influer sur leurs modes de croissance. La contamination croisée est moins un sujet de préoccupation dans les méthodes de gélose solide car il ya moins de possibilités de projections de liquides transportant des cellules entre les cultures. Si la contamination se produit par l'étranger suspension dans l'air des microbes dans les dosages de gélose solide, il peut souvent être détectés par une inspection visuelle des plaques d'agar solides et ont représenté ou supprimés.
QFA débit est sensiblement plus élevée que celle de méthodes parallèles liquides de deux manières. Tout d'abord, sur la QFA (et SGA) plaques, cultures inoculées sont emballés ensemble plus dense, donnant des cultures plus indépendants par plaque. En QFA il ya généralement 308 cultures, sans compter les cultures de bord non-expérimentales (Figure 1) comcomparativement à des cultures liquides parallèle avec 96 ou 100 cultures par plaque. Deuxièmement, les expériences QFA peut être adapté à un plus grand nombre de plaques. Alors que le nombre de plaques analysés en une seule expérience QFA est seulement limité par l'espace disponible dans une salle incubateur ou chaud, la fréquence minimale admissible de capture d'image et de la fréquence de capture maximale possible, le nombre de plaques dans une expérience de croissance liquide est fortement limitée par la capacité du lecteur de plaque (typiquement une ou deux plaques), ou de l'empileur fixé à la plaque de lecteur (typiquement 25-50 plaques). Nous avons récemment réalisé une expérience entièrement automatisé QFA sur 123 plaques, chacune avec 308 cultures expérimentales, ce qui donne 37,884 cultures simultanées. Nous estimons que le nombre maximum possible des cultures indépendantes qui poussent dans liquide est 96 (cultures / plaque) x 50 (plaques / empileur) = 4800, ce qui représente environ dix fois moins que notre débit QFA. Une alternative pour les écrans de culture liquide est d'utiliser un grand nombre gro automatiséwth dispositifs en parallèle (Tableau 1 de la revue par Blomberg 8), chacun ayant une capacité de un ou deux plaques. Contrôle de la température dans chaque dispositif est indépendant, et ainsi de conditions ne sont pas identiques, mais en supposant qu'ils sont, ce flux de travail, il faudrait au moins 190 de ces dispositifs pour correspondre à un débit QFA (en supposant que 200 cultures liquides par appareil).
En résumé, QFA est un workflow de haute qualité qui peuvent être utilement appliquées à recueillir phénotypes de croissance quantitative dans les deux petites expériences à l'échelle axés et à haut débit écrans. Il est suffisamment souple pour être appliqué efficacement avec différentes exigences pour l'équipement robotique. La composante de calcul du flux de travail QFA est basé sur librement disponible, le code source ouvert.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire et le Centre pour la biologie Système intégré de vieillissement et de la nutrition (CISBAN) pour le soutien et les discussions utiles. Cette étude a été soutenue par la biotechnologie et sciences biologiques du Conseil de recherche (BBSRC) (BB/C008200/1) et le Wellcome Trust (075294, 093088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.