Флуоресценции<em> На месте</em> Гибридизации (FISH) был разработан метод визуального обнаружения вирусной геномной РНК с помощью флуоресцентной микроскопии. Зонд сделал со спецификой с вирусной РНК, которые затем могут быть идентифицированы с помощью комбинации гибридизации и иммунофлюоресценции техники. Этот метод имеет то преимущество, определения локализации вирусной РНК или ДНК в стационарном состоянии, предоставление информации по контролю за оборотом событий внутриклеточных вирусов.
Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8.
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.
FISH / IF совместного анализа является надежным методом для визуализации вирусной РНК в клетках, которая в настоящее время уточняется 9,15,16. В течение нескольких лет, мы разработали более совершенный метод окрашивания для РНК. Этот метод может быть использован на широкий спектр типов клеток при условии зонд специфичен для РНК-мишени 17. Называя зонд с DIG, мы способны визуализировать РНК простым окрашиванием. При окрашивании на РНК и белков в сочетании, FISH / IF совместного анализа стать мощным инструментом для наблюдения клеточных структур и белков / РНК локализации.
Специфика выявления РНК достаточно высок. Это показано на рисунке 2. В некоторых из оригинальных работ, которые направлены на вирусную РНК геномная локализация, FISH установлено, что отсутствие Rev ловушку вирусной РНК в ядре 18. Так как эта, обильная новая информация о вирусных локализации геномной РНК была получена использованием techniquэлектронной изложены здесь. По гиперэкспрессией белка клеточного, конкретных групп населения, и не все из вирусной РНК может быть принужден к локализации в различных регионах ячейки. RILP гиперэкспрессия, который похож на фенотип, полученные при hnRNP A2 исчерпывается миРНК ВИЧ-1-экспрессирующие клетки 13, приводит к тому, РНК заметно накапливаться в КТВМ. Геномной РНК вируса могут быть прижаты к периферии клетки, отключив минус-концу белка двигателя, динеин: p50/Dynamitin гиперэкспрессия или нокдаун динеин тяжелой цепи 1 приводит к освобождению вирусного генома РНК из внутриклеточных доменов сотовой периферии ( Рисунок 2). Мутант RILP, RILPΔN, которые уже не связывает динеин двигателя, рассеивается эндосомы (помечены LAMP1) в цитоплазму, потому что они больше не активно локализованы на juxtanuclear области. Эти результаты указывают на понятие пластикового населения РНК ВИЧ-1 генома и, в частности, что различные бассейны ВИЧ-1 геномаРНК существует с иногда идентифицировать роль в репликации вируса. Эти же понятия уже определены для белка, кодируемого этой мРНК, Gag 19.
Существуют ограничения на использование FISH / IF совместного анализа, связанные с выбором антител и доступность. Оптимизация лучшее сочетание первичных и вторичных антител и их концентрации, потребуется время, чтобы оптимизировать (см. Таблицу 1 и 2). Антитела из гибридом, или производятся крупными компаниями может иметь концентрациях, которые варьироваться от 1:2 до 1:2000, но обязательно следуйте указаниями производителя для достижения наилучших результатов. Хозяина, в котором антитела производятся также должны быть приняты в стадии рассмотрения. Смешивание овец с козьими антителами также следует избегать в начальной и средней антител, так как это сочетание приводит к высоким фоном из-за перекрестного признания видов (данные не представлены). Для Alexa Fluor-secondaры антител, концентрации могут быть использованы при 1:500 практически для любых антител в наборе. Другой недостаток FISH / IF совместного анализа, как описано в настоящем докладе, это отражает РНК в месте его нахождения в стационарном состоянии, после того, как клетки были зафиксированы и проницаемыми использованием параформальдегид и моющих средств (рис. 1).
Тем не менее, РНК изображений в живых клетках было достигнуто с помощью различных средств 20-22, в основном используя вариации вирусных геномов РНК, помеченные флуоресцентными белками, такими как GFP. Тем не менее, дополнительные средства для выявления РНК локализация в живых клетках продолжать поверхность. Эти новые методы включают пометки РНК с помощью шпината 23, SNAP 24, или MTRIP 2. Эти методы также страдает от нескольких недостатков, включая требования к permeabilize клетки перед добавлением субстратов или часть должна быть разработана, чтобы отметить мРНК в целях обнаружения мРНК с помощью микроскопа. Действительно, основные ADVAntage из FISH анализа, изложенные в этом докладе, заключается в том, что родной РНК неизменной, ведущие к наиболее физиологически релевантные результаты.
The authors have nothing to disclose.
Авторы выражают благодарность прошлого и настоящего членов лаборатории за вклад в развитие методологии, изложенной здесь и Алан Кокрановского за советом. LA является получателем канадских институтов здравоохранения (CIHR) исследовательских стипендий и AJM поддерживается премии карьеры Фрейзер, Monat и Макферсона. Работа выполнена при поддержке гранта от CIHR (грант № СС-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.