A fluorescenza<em> In situ</emIbridazione> (FISH) metodo è stato sviluppato per rilevare visivamente virali RNA genomico mediante microscopia a fluorescenza. Una sonda è fatta con specificità per gli RNA virali che possono poi essere identificati utilizzando una combinazione di tecniche di ibridazione e di immunofluorescenza. Questa tecnica offre il vantaggio di individuare la localizzazione di RNA o DNA virale allo steady-state, fornendo informazioni sul controllo di eventi intracellulari traffico di virus.
I virus che infettano le cellule sollecitare modifiche specifiche funzioni cellulari normali che servono a deviare l'energia e le risorse per la replicazione virale. Molti aspetti della funzione della cellula ospite sono comandati da virus, di solito l'espressione di prodotti genici virali che reclutano le proteine della cellula ospite e macchinari. Inoltre, virus organelli membrana ingegnere tag specifiche o di vescicole su cellulari e proteine motrici a regioni bersaglio della cellula (durante l'infezione de novo, i virus cooptare proteine motore molecolare per colpire il nucleo, poi, durante l'assemblaggio del virus, saranno dirottare cellulare macchinari che aiuteranno nel montaggio di virus). Minore è inteso come il virus, in particolare quelli con genomi di RNA, coordinare il traffico intracellulare di proteine e componenti RNA e come ottenere assemblaggio di particelle infettive in loci specifici nella cellula. Lo studio della localizzazione RNA è iniziato nel lavoro precedente. Sviluppare em eucariotici inferioribryos e cellule neuronali fornito importanti informazioni biologiche, e ha anche sottolineato l'importanza della localizzazione RNA nella programmazione delle cascate di espressione genica. Lo studio in altri organismi e sistemi cellulari ha prodotto simile informazioni importanti. I virus sono parassiti obbligati e devono utilizzare le loro cellule ospiti per replicare. Pertanto, è fondamentale per comprendere come RNA virus dirigere loro genomi RNA dal nucleo, attraverso il poro nucleare, attraverso il citoplasma e su una delle sue destinazioni finali, in particelle di virus progenie 1.
FISH serve come uno strumento utile per identificare i cambiamenti a regime localizzazione di RNA virale. Quando combinato con immunofluorescenza (IF) analisi 22, FISH / IF co-analisi fornirà informazioni sulla co-localizzazione delle proteine con l'RNA virale 3. Questa analisi fornisce quindi un buon punto di partenza per verificare le interazioni RNA-proteina da loro o biochimica-biofisicaprove di 4,5, in quanto co-localizzazione di per sé non è una prova sufficiente per essere certi di una interazione. Nello studiare la localizzazione di RNA virale utilizzando un metodo come questo, molte informazioni sono state acquisite da entrambi i virali e cellulari RNA 6 eventi di traffico. Ad esempio, HIV-1 RNA produce nel nucleo delle cellule infette, ma l'RNA viene soltanto tradotta nel citoplasma. Quando una proteina chiave virale manca (Ap) 7, FISH del RNA virale ha rivelato che il blocco di replicazione virale è dovuto alla ritenzione di HIV-1 RNA genomici nel nucleo 8.
Qui, presentiamo il metodo per l'analisi visiva di RNA genomico virale in situ. Il metodo fa uso di una sonda marcata RNA. Questa sonda è progettata per essere complementare alle RNA genomico virale. Durante la sintesi in vitro di RNA antisenso sonda, il ribonucleotide che viene modificato con digossigenina (DIG) è incluso in uno in vitro transcription reazione. Una volta che la sonda si è ibridata con il mRNA bersaglio in cellule, successive fasi di etichettatura anticorpo (Figura 1) rivelerà la localizzazione del mRNA e proteine di interesse durante l'esecuzione di FISH / IF.
PESCE / IF co-analisi è un metodo affidabile per visualizzare l'RNA virale nelle cellule che ora è stato perfezionato 9,15,16. Nel corso di diversi anni, abbiamo sviluppato un metodo raffinato di colorazione per l'RNA. Questa tecnica può essere usata su una vasta gamma di tipi cellulari purché la sonda è specifico per la RNA bersaglio 17. Per l'etichettatura la sonda con DIG, siamo in grado di visualizzare i RNA mediante colorazione semplice. Quando colorazione per l'RNA e altre proteine si combinano, FISH / se la co-analisi diventare un potente strumento per osservare le strutture cellulari e le proteine / RNA di localizzazione.
La specificità della rivelazione RNA è piuttosto elevato. Questo è illustrato nella figura 2. In una parte del lavoro originale che si è concentrato sulla localizzazione genomico virale RNA, FISH stabilito che la mancanza di Rev intrappolato RNA virale nel nucleo 18. Dal momento che questo, abbondante nuove informazioni sulla localizzazione virale RNA genomico è stato ottenuto utilizzando il technique qui delineato. Con overesprimenti proteine cellulari, specifiche e le popolazioni non tutti, gli RNA virali possono essere costretti a localizzarsi a differenti regioni della cella. Sovraespressione RILP, che ricorda il fenotipo ottenuto quando hnRNP A2 è esaurito da siRNA in HIV-1-cellule che esprimono 13, fa sì che il RNA di accumulare visibilmente al MTOC. Le RNA genomici virali possono essere spinti alla periferia cellulare disabilitando il minus-end proteina motore, dineina: sovraespressione p50/Dynamitin o knockdown delle pesanti catene dineina 1 risultati nel rilascio di RNA genomici virali provenienti da domini intracellulari alla periferia cellulare ( Figura 2). Un mutante di RILP, RILPΔN, che non lega più il motore dineina, si disperde endosomi (contrassegnati da LAMPADA1) nel citoplasma perché non sono più attivo localizzato a domini juxtanuclear. Questi risultati indicano l'idea di una popolazione di plastica di HIV-1 RNA genomici e in particolare, che diversi gruppi di HIV-1 genomicaRNA presenti con ruoli a volte identificabili nel ciclo di replicazione virale. Queste nozioni stesse sono già stati individuati per la proteina codificata da questo mRNA, Gag 19.
Ci sono limitazioni agli usi di FISH / se la co-analisi che sono legati alla scelta degli anticorpi e la disponibilità. L'ottimizzazione della migliore combinazione di anticorpi primari e secondari, e le loro concentrazioni, ci vorrà del tempo per ottimizzare (vedi Tabella 1 e 2). Anticorpi a base di ibridomi o prodotte da grandi aziende possono avere concentrazioni che variano ovunque da 1:2 a 1:2000, ma essere sicuri di seguire le linee guida fornite dal produttore per i migliori risultati. L'host in cui si produce l'anticorpo deve essere presa in considerazione. Pecore di miscelazione con anticorpi di capra dovrebbe anche essere evitato in anticorpi primari e secondari, come questo si traduce in combinazione fondo elevato a causa di cross-riconoscimento della specie (dati non riportati). Per Alexa-Fluor Secondaanticorpi Ry, la concentrazione può essere utilizzato a 1:500 per quasi tutte anticorpo nel set. Lo svantaggio a pescare / IF co-analisi, come descritto nella presente relazione è cattura le RNA nella sua posizione allo stato stazionario, dopo che le cellule sono state fissate e permeabilizzate con paraformaldeide e detergente (Figura 1).
Tuttavia, RNA di imaging in cellule vive è stato ottenuto attraverso una varietà di mezzi 20-22, principalmente utilizzando varianti di genomi virali RNA che sono contrassegnati da proteine fluorescenti come la GFP. Tuttavia, ulteriori mezzi per identificare la localizzazione di RNA in cellule vive continuano ad emergere. Questi nuovi metodi coinvolgere i tag RNA per mezzo di Spinaci 23, 24, o SNAP MTRIP 2. Queste tecniche soffrono anche di alcuni inconvenienti tra cui il requisito di permeabile cellule prima di aggiungere substrati o una porzione che deve essere progettato per codificare l'mRNA per rilevare l'mRNA da microscopia. Infatti, la maggiore ADVAntage di analisi FISH descritte nella presente relazione risiede nel fatto che l'RNA nativo è inalterata porta ai risultati più fisiologicamente rilevanti.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano i membri passati e presenti del laboratorio per i contributi allo sviluppo della metodologia qui delineato e Alan Cochrane per un consiglio. LA è destinatario di un Canadian Institutes of Health Research (CIHR) dottorato e AJM è supportato da un premio alla carriera Fraser, Monat e MacPherson. Questo lavoro è supportato da un finanziamento della CIHR (sovvenzione # MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.