Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

1. Yüksek basınçlı Donma Da numune için uygun bir ortamda (örneğin, hücre kültürleri için kültür ortamı, C. elegans için M9) 1 ml BSA içine 0.2 g eklenmesi ile kriyo-koruyan hazırlayın. Her BSA eriyene kadar 37 ° C su banyosu içinde tüp inkübe edin. Dondurma öncesinde, sıvı nitrojen ile otomatik donma-ikame cihazı (Leica AFS) doldurun AFS programı ayarlayın: -90 ° C 5-30 saat *, 5 ° C / saat -60 ° C, -60 ° 2 saat (ya da Leica AFS 2 kullanıyorsanız "pause" seçeneğini seçin) için C, 72 saat için 5 ° C / saat için -30 ° C ve -30 ° C. AFS makinenin fazla beş adım olma özelliğine sahip ise, -30 ° C adım 0 saat ayarlanmış bir "duraklama" seçeneği ile değiştirilmesi gerekir, ve iki ileri adımlar eklenmelidir: 10 ° C / -20 ° sa -20 ° C de 24 saat ve C Makinenin beş adım ile sınırlı ise, aşağıdaki gibi farklı bir bellek yuvasına başka bir program kurmak: 10 ° C ile -20 / sa ° C ve 24 saat-20 ° C'de r Burada * saat -60 ° C adımı sabah erken başlayan şekilde ayarlanabilir. Susuz aseton (EMS, # RT10016) 10 ml 0,1 g osmiyum tetroksit kristaller (EMS, RT19134) karıştırılması ile% 1 osmiyum tetroksit stok çözelti hazırlayın. Aşağıdaki gibi, bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde fiksatif hazırlayın. Birincisi, milliQ su 1 ml ekleyin ve sonra potasyum permanganat 0.02 g (EMS, RT20200) çözülür. Aseton 19 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Son olarak, tüp içine% 1 osmiyum stok solüsyonu 20 ul ilave edin. Aseton, bir serbest-radikal süpürücü 11 olduğunu ve bu nedenle plastik polimerizasyon önler, ancak dondurularak-ikame ortamı olarak aseton kullanımı nedeniyle lipid ile etkileşimi morfolojisini muhafaza etmek için gereklidir. Aseton plastik sızma önce etanol ile ikame edilir. Tablet 1 Her cryovial için ml ve sıvı azot içinde tüpler depolayarak donmuş fiksatif tutun. % 20 BSA veya bakteri ile bir numune taşıyıcı doldurun.% 20 BSA ve bakteri Hem kriyo-koruyucuları olarak hizmet vermektedir. Örnek taşıyıcının tipi için tercih numune bağlıdır. C. için elegans, iyi bir 100 mikron kullanın. Taşıyıcıya örneği yerleştirin ve bir yüksek basınç dondurucu kullanarak dondurma. Dondurma işleminden sonra ve sıvı azot altında, fiksatifler içeren cryotube içine örnek aktarın. Numunenin her zaman sıvı altında kalır emin olun. ) 1.5 Tekrar – 1.7) tüm örneklerin donmuş kadar. AFS biriminin içine tüm cryotubes aktarın ve program kaldığı yerden devam. 2. Freeze-ikame Sıcaklık -60 ° C'ye ulaştığı zaman, AFS olarak% 95 aseton ihtiva eden 20 ml yer kapsüller. Sıcaklığı -50 ° C ulaştığında, altı kez 2 saatlik dönemi boyunca% 95 aseton ile fiksatif değiştirin. Odasına% 95 aseton içinde% 0.1 'lik uranil asetat, 20 ml (Polysciences, # 21447-25) içeren bir şişe yerleştirin veön-serin -50 ° C Yıkama aşamasının sonunda, her bir şişeye uranil asetat solüsyonu ~ 1 ml eklenir. Gerekirse programı unpause. Sıcaklığı -30 ° C ulaştığında, altı kez 2 saatlik dönemi boyunca% 95 etanol ile uranil asetat değiştirin. Bu arada, 22.3 ml GMA, 10ml n-bütil metakrilat, 1 ml milliQ su ve 0,2 g benzoil peroksit karışımı ile% 97 glikol metakrilat rezin (GMA, SPI Malzemeleri / Yapı Probe, Inc # 02630-AA) makyaj (katalizör). (EMS, # 72632) cam şişe içinde saklayın ve% 95 etanol ile karıştırılarak% 30 GMA hazırlamak. Polimerizasyon kaliteli polietilen bazlı plastik uzun süreli depolama düşürür çünkü plastik tüplerde GMA medya tutmayın. -30 ° C'ye Pre-serin GMA çözümü Onlar susuz ve floresan proteinleri doyurur hangi asidik olduklarından böyle Araldite ve EPON gibi geleneksel epoksi reçine protokolde kullanılamaz. Böyle LR Beyaz, c Akrilik reçineler,bir su ve küçük bir miktar tolerans ve floresan protein korumak, ancak onun asidik pH fluorofor 12 gidermek eğilimindedir. GMA aslında, su gerektiren bir miktar ve (PH8) 12 alkalidir, tolere eder. GMA ne yazık ki biraz kırılgandır. Ayrıca, GMA geleneksel epoksi reçine yok gibi dokuları ile çapraz bağ değil. Kaliteli kesit GMA neden tutarsızlık Bu özellikler özellikle 80 nm den daha ince kesitli. GMA raf ömrü yaklaşık bir yıl olmasına rağmen, GMA kalitesini sağlamak için satın alma 3 ay içinde kullanılmalıdır. 3. Sızma ve Polimerizasyon Adımlar 3.1-3.3 dondurularak-ikame için kullanılan aynı cryovials içinde gerçekleştirilmektedir. Sızma ve polimerizasyon floresan protein korumak için AFS olarak -30 ° C 'de yapılmaktadır. % 95 etanol ile GMA stok solüsyonu karıştırılarak infiltrasyon ortam hazırlayın. Örneklerin inkübe3-5 saat boyunca% 30 GMA. 4-6 saat boyunca% 70 GMA numune inkübe edin. Gecede% 97 GMA numune inkübe edin. Bir sonraki gün, taze% 97 GMA oluşturmaktadır. Bir gömme kalıp (EBSciences, # TC) örnekleri aktarın. "DİSK Delgi (Ted Pella Inc) bir 3/8 ile Aclar filmin bir disk (EMS, # 50425-10) hazırlayın ve BEEM kapsül altındaki diskin yerleştirin. Değişim -30 ° C'de% 97 GMA üç kere 6 saat boyunca Üçüncü değişimden sonra, 1.5 ul / 1 ml GMA 'lik bir konsantrasyonda GMA için başlatıcı N, N-dimetil-p-toluidin (Sigma-Aldrich, # D9912) eklenir ve her bir numune için kalıp bu çözüm uygulanır. Hemen AFS gömme kalıp örneği yerleştirin. Benzoil peroksit kadar karıştırma gerekli değildir katalizör ve her sızma adımlar boyunca mevcut olduğuna dikkat edin. Bu kimyasal başlatıcı N, N,-dimetil-p-toluidin maruz kalınca benzoil peroksit plastik Polimerize değildir. Başlatıcı pol etkinleştirirymerization derhal ve 1 saat içinde bile dokularda reçine Polimerize olacaktır. Bununla birlikte, doku kopmalar eksik polimerizasyon dolayı dokularda neden olabilir. Ayrıca, GMA, iyi blok numune çapraz kalmaması bakterilerin matris üzerine dokunarak kriyoprotektan gelen numune ayırın. Polimerizasyon bir AFS dışında gerçekleştirilir, gömme kalıp oksijene maruz kalmasını engellemek için bir Aclar diski ile örtülmesi gerekir. Oksijene maruz kaldığında GMA tamamen polimerize değildir. O 1 saat içinde polimerize olsa plastik gecede dinlenmeye bırakılmalıdır. Floresan proteinleri oksijene maruz kalmayacakları şekilde işlenmesi kadar dondurucuda bir nitrojen gazlı vakum torbası (Ziploc) (-20 ° C) örnek saklayın. 4. Kesit GMA-gömülü örneklerinin Kesit EPON-gömülü numuneler için benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ekstra dikkat çekmek olmalıdırGMA çok hidrofilik ve onlar her iki tarafta ıslatılmış halinde şeritler su banyosu içine tahrik olacak, çünkü n kesit yüzeyi ıslatmaya değildir. Bir TIRF mikroskop lokalizasyonu için kullanılmakta ise bir cam lamel üzerine bölümler (50-80 nm) kurdeleler toplayın. Aksi takdirde, transmisyon elektron mikroskobu için yapılmış bir ızgara kullanın. Kesme hızı at1.6 mm / sn veya daha yüksek olarak ayarlanması gerekir. Aksi takdirde, bir şerit oluşturur olabilir. -20 ° C'de saklayın bölümler hemen olmasa görüntülendi. Alüminyum folyo ile bölüm sahipleri kaplayarak UV ışınlarından floroforlar koruyun. 5. PALM Görüntüleme Üretici tavsiyelerine göre PALM mikroskobu ayarlayın. Bir EMCCD Kameranın sıcaklığı ° C veya altında -70 ayarlanmış olmalıdır. Görüntülenecek örnek çözeltisi (yaklaşık 50 ul) – altın parçacıkları (2x konsantre, mikroküreler-nanospheres.com # 790122-010) uygulayın. Çözüm kapaklarına 30 saniye bekletinsiyah bir örtü halinde altında iken dudak. Lamel kenarına üfleme ve Kimwipe ile emerek altın çözeltisi çıkarın. Dairesel lamel yuvasına lamel yerleştirin. Gerekirse, yerinde lamel tutmak için jant için vakum gres de geçerlidir. Doğrudan örnekleri aşağıda, lamel alt kısmına immersiyon yağı uygulayın. Mikroskop sahnede yuvaya numune tutucusunu yerleştirin. Hedefleri dokunmamaya özel dikkat gösterin. Sıkı ve nesnel yukarıdaki bölümlerde ortalar yüzden tutucu ayarlayın. 10x objektif lens kullanarak bölümlerini bulun. 100x objektif lens değiştirin. Numune odaklanın. Flöresan sinyalleri gücü gözlenmesi ile, ilgilenilen bir bölge bulun. 488 nm lazer kullanın ve% 10 Kanallar menüsünden yoğunluğunu artırır. Parlak floresan alanlara odaklanın. Bu adım gerekli değildir unutmayın bölgede o takdirdef ilgi göz tarafından parlak saha içinde tespit edilebilir. 561 nm lazer açın ve arka plan otofloresans dışarı ağartıcıya% 100 yoğunluğunu artırır. ~ 2 dk Bleach örnek. Bleaching sırasında odak değişirse, odak ayarlayarak ve görüntü yakalamak önce geçmesi gereken 5 dakika bekleyin. Bu duraklatma ısı stabilize etmek için olanak sağlar. PALM kapsamı kuluçka odası ile donatılmış ise, 20 sıcaklığını ayarlamak ° C ve odasında sıcaklık stabilize etmek ~ 2 saat bekleyin. Ağartma işlemi tamamlandığında, 405 nm lazer etkinleştirmek ve düşük yoğunluk ayarlayın. Saniyede 20 kare görüntü toplamaya başlayın. Bu deney, genellikle 5,000-6,000 kare başına toplamak, ancak kare sayısı, deneyin amacına bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir. Ilgi çekici bir bölgedeki bütün proteinler yansıması gerekmesi halinde, örneğin, kare sayısı arttırılmalıdır. Sinyalleri seyrek veya soluksa, yavaş increase 405 nm lazer yoğunluğu. Satın alma işlemi sırasında, dikkatli gerekli düğmesini ayarlayarak odak örnekleri tutmak için emin olun. Görüntüler elde edildiğinde, PALM analiz yapılmalıdır. TdEos için, bu sinyalleri olasılıkla otofloresans nedeniyle çünkü 500 milisaniye daha uzun floresan herhangi sinyaller filtre. 6. SEM Görüntüleme SEM görüntüleme öncesi ve 4 dakika için% 2.5 uranil asetat (sulu) kullanılarak bölümlere leke. Filtrelenmiş milliQ su ile iyice uranil asetat yıkayın. Bölümleri kurutulur sonra lamel oldukça koyu hale gelene kadar, bir karbon kullanarak karbon-ceket lamel sputter. Lamel yüzeyi üzerinde birikir elektron topraklı metal, böylece saplama üzerinde lamel ve diğer uç kenarında karbon iletken bant bir ucunu uygulanır. SEM bölmesine (FEI Nova Nano) içine numune monte edin. VCD dedektörü yerleştirin. </li> Odanın kapatın ve yüksek vakum ayarı kullanarak pompalayacak. Bu elektron demeti bir örnek uygulanır böylece sonra tahliye, sütun vanasını açın. Elektron demeti bir rutin hizalama gerçekleştirin. Örnek bulun. Odak ayarlanmış sonra, numune aşama bağlantı ve kutup parçasının altına 5 mm için sahne getirmek. Numunede (~ 5,000 x) düşük bir büyütme görüntü çeker. Ilgi bölgeye Zoom ve (50,000 x) görüntüler yüksek büyütme elde. Sonraki bölüme taşıyın ve tüm bölümleri görüntülü kadar adım 6.10) ve 6.11) tekrarlayın. 7. Hizalama PALM ve EM Görüntüler Açık Photoshop ve kazanılmış SEM görüntüleri. 5,000 x 5,000 piksel ve 300 piksel / inç çözünürlüğü boyutları ile yeni bir pencere oluşturun. Yeni pencerede (Şekil 1A) içine düşük büyütmeli SEM görüntüsü kopyalayın. O kadar doldurur, böylece görüntü Scaledönüşümü manipülasyon (Command + Mac için T) kullanarak tüm pencere. SEM görüntüleri yüksek büyütme kopyalayın ve bunları gerektiği gibi büyütmek. Açılan resim menü çubuğundan görüntü döndürme seçerek yatay toplamı TIRF Resmi çevirin. Toplamı TIRF görüntü (PALM itibaren) yeni bir katman içine kopyalayın ve yapıştırın. SEM görselleştirilmiş ilgili yapılar (Şekil 1B) ile altın parçacıkları (Şekil 1A beyaz oklar) floresans maç gerekli döndürerek dönüşüm manipülasyon kullanarak görüntü ölçekleme ve. Yeni bir tabaka haline PALM görüntüyü kopyalayın ve aynı dönüşümü (Şekil 1C) uygulanacaktır. Daha yüksek bir büyütme Bu resim (Şekil 2) elde edilebilir. Sunum için, yeni bir tabaka haline dönüştürdü PALM görüntü kopyalayabilirsiniz. "Select" açılır menüsünden "renk aralığını" kullanarak PALM sinyalleri ancak arka plan seçin. Sel emin olunbir referans piksel olarak bir arka plan pikseli ect ve "invert" seçeneğini etkinleştirin. İstediğiniz PALM sinyaller kesin ve yeni bir katmana yapıştırın. Arka plan katmanı şeffaflık uygulayın ve% 10 olarak ayarlayın. Bu, yoğunluk (Şekil 2B) bozmadan arka plan saydam hale getirerek PALM sinyallerinin görüntülenmesi için olanak sağlar. 8. Temsilcisi Sonuçlar TdEos ile etiketlendi Histon stably nematod C. ifade edilebilir elegans ve transjenik hayvanlar yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak işleme tabi tutulmuştur. PALM ve elektron mikroskop aynı bölüm (Şekil 1) elde edilmiştir. Görüntüleri hizalamak için, tüm zaman boyunca floresans özetliyor toplamı TIRF görüntü, elektron mikrografı üzerine örtülmektedir. Altın nanopartiküller floresans ve elektron mikroskop hem görünür ve 'transf kullanarak iki görüntü hizalamak için kullanılabilirPhotoshop orm 'fonksiyonu (Şekil 1A ve B). Daha sonra, aynı 'transform değer PALM resim (Şekil 1C) uygulandı. Bu büyütme anda, yapısal detay ayırt edilemez, bu yüzden mikrografı (Şekil 2) üst sonuna yakın bir bölgeye yakınlaştırılmış. Yüksek büyütme görüntü, böyle bir çekirdek, bir çekirdekçik, nükleer gözenekler ve endoplazmik retikulum gibi hücre içi detayları gözlenebilir. Ayrıca, Histon etiketli moleküller sadece çekirdek için lokalize olan ancak çekirdekçik için, beklendiği gibi. Korelatif PALM ve elektron mikroskobu böylece yüksek çözünürlükte protein lokalizasyonu için izin verir. Beş sorunları görüntülerin kalitesini bozabilir. Birincisi, buz kristali hasar (Şekil 3A ve B) ultrastrüktürel deforme edebilirsiniz. Buz kristallerinin yayılımı azaltır gibi kriyo-Koruyucu bakteri, numune vermek, bu hasarı azaltabilir. Bununla birlikte,hala elektron mikroskobu ile örneklerin taranması ve donma eserler ile bu atmalı. İkincisi, GMA epoksi reçineler gibi dokulara bağlantı geçmez, ve böylece örneklerinde genellikle çevredeki plastik ve streç kurtularak, küçültmek ya da bölüm (Şekil 3C ve D) dışındadır. Uzaklıkta kriyo-Koruyucu gömmeden önce bakteriler veya diğer gelen örnek Diseksiyon örneği (Şekil 3C) plastik daha fazla yapışma sağlar. Benzer şekilde, bağırsak dokusunda lipid damlacıkları gibi yapılar genellikle çapraz bağlama yokluğunda (Şekil 3E) nedeniyle dokulardan ayrışmak. Üçüncü olarak, doku ya da germe katlama plastik nedenlerden eksik polimerizasyonu (Şekil 3F), örnek olarak oksijen varlığı da GMA polimerizasyonu engellemektedir. Dördüncü, GMA yoksul kesit kalitesi genellikle tutarsız bir morfoloji (Şekil 3G ve H) ile sonuçlanır. GMA bölümlerde kesilmelidir70 nm veya daha kalın ve çevresinde 1,6 mm / s hızında eserler Kesit en aza indirmek için. Beşinci olarak, lamel veya bölüm tozla plan otofloresans kaçınılmazdır. Tozdan Otofloresansı önceden temizlenmiş lamelleri kullanarak ve protokol açıklandığı gibi Kimwipes ve filtre kağıdı toz kirlenmesini önlemek minimize edilebilir. PALM analiz programı floresan proteinleri tipik sinyalleri (Şekil 2 A ve B) daha uzun floresan örnek veya plastikten sinyalleri düzenleyebilirsiniz. Son görüntü bu nedenle bu eserler ücretsiz olacaktır. Şekil 1. Altın nanopartiküller kullanılarak floresans ve elektron mikroskop hizalama. C. bir kesiti (A), düşük bir büyütme elektron mikrografı tagged histon tdEos ifade elegans :: HIS-11. Beyazrrows elektron-yoğun altın öncesinde konvansiyonel işaretleri olarak hizmet PALM görüntüleme uygulandı nanopartiküller 100 nm göstermektedir. (B) altın boncuk ~ 580 nm ışık maruz kalma üzerine floresan ve floresan görüntü indirgeme işaretleri oluşturmak. Toplamı TIRF görüntü indirgeme işaretlerinin yere göre bir elektron mikrografı üzerine hizalanır. Toplamı TIRF görüntü deney süresi boyunca kamera tarafından algılanan tüm fotonları temsil eder. Üst sol (beyaz ok) üzerinde parlak noktalar altın parçacıkları kümeleri ortaya dikkat ediniz. (C) Bir PALM görüntü sonra elektron mikrografı ve döndürülmüş eklendi ve (B) toplamı TIRF görüntünün hizalamasını belirlenen değerlere dayalı çevrilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın . <br /> Şekil 2. TdEos arasında Histon füzyon proteinleri kullanarak nano-FEM Korelatif. (A) Sum TIRF görüntü :: HIS-11 ince kesit (70nm) elde. TdEos (B) Sorumlu PALM görüntü :: HIS-11. Otofloresans (beyaz ok) süren uzun 500 msn PALM programı tarafından süzüldü. (C) Bir çekirdeğin elektron mikrografı Aynı bölümde elde. (D) Korelatif PALM görüntü ve tdEos elektron mikrografı :: HIS-11. Floresans sıkıca çekirdeğinde kromatin lokalize edilmektedir. Şekil 3. Nano FEM ile ilgili problemler. Bir C (A) elektron mikrografı buz kristali zarar vermeden elegans vücut kas. Buz kristali hasarı olan bir vücut kas (B) Elektron mikrografı. Bunun yerine ayrık kesit, aktin ve miyozin filamentleri buz kristallerinin oluşumu nedeniyle agrega içine yıkılmıştır. (C, D) Düşük büyütme elektron mikrografıs çevreleyen medya solucanlar ayrışma gösteren. Bölümünde numune plastik (C) ile çevrili olduğunda daha kriyo-koruma bakteriler (D) ile çevrili bir örnek daha bozuk. Gallette içinde bakteri kriyo-koruyan bir plastik yerleştirme önce sabit örnek uzak disseke olmalıdır. (D) 'de sağ tarafta hayvan yatay kesitli geldiğini belirtmek gerekir, ve böylece şekil dokuların bozulması nedeniyle değildir. Dokuların bırakması (siyah oklar) gösteren bağırsak bölgesinin (E) elektron mikrografı. Plastik eksik polimerizasyonu (siyah oklar) bağlı bölümlerin katlanması gösteren sinir halka (F) elektron mikrografı. Farklı tarihlerde sectioned Aynı örnekten nöron (G, H) elektron mikroskobu,. Dokuların korunması bir gün (G) süper ama böyle morfolojisi tutarsız kesit kalitesi (H) tarafından kapatmamasını. v için buraya tıklayıniew büyük bir rakam.