Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

1. Ad alta pressione di congelamento Preparare la crio-protectant aggiungendo 0,2 g di BSA in 1 ml di un mezzo appropriato per il campione (per esempio, mezzo di coltura per colture cellulari, M9 per C. elegans). Incubare la provetta in un bagno di acqua 37 ° C fino a quando tutto BSA è disciolto. Prima di congelamento, riempire il blocco automatico di sostituzione del dispositivo (Leica AFS) con azoto liquido Impostare il programma AFS: -90 ° C per 5-30 ore *, 5 ° C / h fino a -60 ° C, -60 ° C per 2 ore (o selezionare l'opzione "pausa" se si usa Leica AFS 2), 5 ° C / h fino a -30 ° C e -30 ° C per 72 ore. Se la macchina AFS è in grado di avere più di cinque passi, la fase C ° -30 dovrebbe essere sostituito con l'opzione "pausa" impostato a 0 ore, e due passi dovrebbero essere aggiunte altre: 10 ° C / h fino a -20 ° C e 24 ore a -20 ° C. Se la macchina è limitata a cinque fasi, impostare un altro programma in uno slot di memoria diverso come segue: 10 ° C / h fino a -20 ° C e 24 hr a -20 ° C. * Il tempo qui può essere regolata in modo che la fase C ° -60 inizia al mattino presto. Preparare 1% tetrossido di osmio soluzione stock di miscelazione 0,1 g cristalli di tetrossido di osmio (EMS, RT19134) con 10 ml di acetone anidro (SME, # RT10016). Preparare i fissativi in ​​una provetta da 50 ml come segue. In primo luogo, aggiungere 1 ml di acqua MilliQ, per poi dissolversi in esso 0,02 g di permanganato di potassio (EMS, RT20200). Aggiungere 19 ml di acetone e mescolare bene. Infine, aggiungere 20 ml di soluzione di osmio all'1% magazzino nel tubo. Acetone è un radicale libero scavenger 11 e quindi impedisce la polimerizzazione di plastica, ma l'uso di acetone come freeze-sostituzione mezzo è indispensabile per conservare morfologia a causa della sua interazione con i lipidi. Acetone verrà sostituito con etanolo prima infiltrazione plastica. Aliquotare 1 ml a ciascuna provetta Microbank ™ e mantenere i fissativi congelati memorizzando i tubi in azoto liquido. Riempire un vettore campione con il 20% di BSA o batteri.Entrambi BSA 20% e batteri servono come crio-protettori. La scelta del tipo di vettore campione dipende dal campione. Per C. elegans, utilizzare un 100 micron bene. Porre il campione nel supporto e bloccarlo usando un congelatore ad alta pressione. Dopo il congelamento e sotto azoto liquido, trasferire il campione nel CryoTube contenente fissativi. Assicurarsi che il campione rimane sotto il liquido in ogni momento. Ripetere 1.5) – 1.7) fino a quando tutti i campioni sono congelati. Trasferire tutti i cryotubes nell'unità AFS, e riprendere il programma. 2. Freeze-sostituzione Quando la temperatura raggiunge -60 ° C, flaconi posto contenenti 20 ml di acetone al 95% in AFS. Quando la temperatura raggiunge -50 ° C, sostituire i fissativi con 95% acetone sei volte durante il periodo di 2 ore. Collocare un flacone contenente 20 ml di acetato di uranile 0,1% (Polysciences, # 21.447-25) in 95% acetone nella camera epre-raffreddare a -50 ° C. Al termine della fase di lavaggio, aggiungere ~ 1 ml di soluzione di acetato di uranile ad ogni flacone. Riprendere il programma, se necessario. Quando la temperatura raggiunge -30 ° C, sostituire l'acetato di uranile con etanolo al 95% sei volte durante il periodo di 2 ore. Nel frattempo, costituiscono il 97% di resina glicol metacrilato (GMA, SPI Supplies / Structure Probe, Inc., # 02.630-AA) miscelando 22,3 ml GMA, 10 ml di n-butil metacrilato, 1 ml di acqua MilliQ, e 0,2 g di perossido di benzoile (catalizzatore). Conservare in flaconi di vetro (SME, # 72632) e preparare 30% GMA mescolandolo con il 95% di etanolo. Non conservare i supporti GMA in tubi di plastica perché la qualità di polimerizzazione degrada con la conservazione a lungo termine in polietilene a base di materie plastiche. Pre-raffreddare la soluzione GMA a -30 ° C. Resine epossidiche tradizionali come Araldite Epon e non possono essere utilizzati nel protocollo essendo anidro e acido che disseta proteine ​​fluorescenti. Resine acriliche, come LR White, cun tollerare una piccola quantità di acqua e può conservare la proteina fluorescente, ma il suo pH acido tende a spegnere il fluoroforo 12. GMA tollera, infatti richiede, una piccola quantità di acqua ed è alcalina (pH 8) 12. GMA è purtroppo un po 'fragile. Inoltre, GMA non cross-link con tessuti come le resine epossidiche tradizionali. Queste caratteristiche di incoerenza causa GMA sezionamento in qualità specialmente quando sezionata più sottile di 80 nm. Sebbene la durata del GMA è circa un anno, GMA deve essere utilizzato entro 3 mesi dalla acquisto per garantire la qualità. 3. Infiltrazione e Polimerizzazione Passi 3,1-3,3 sono svolte nei cryovials stessi utilizzati per freeze-sostituzione. Infiltrazione e polimerizzazione vengono effettuate a -30 ° C in AFS per preservare la proteina fluorescente. Preparare i supporti infiltrazione mescolando la soluzione madre GMA con il 95% di etanolo. Incubare i campioniin GMA 30% per 3-5 ore. Incubare i campioni in% GMA 70 per 4-6 ore. Incubare i campioni in% GMA 97 durante la notte. Il giorno dopo, costituiscono fresco 97% GMA. Trasferire i campioni ad un stampo incasso (EBSciences, # TC). Predisporre un disco di pellicola ACLAR (EMS, # 50.425-10) utilizzando un 3/8 "DISC Punch (Ted Pella Inc.) e posizionare il disco nel fondo della capsula BEEM. Cambio il 97% GMA tre volte più di 6 ore a -30 ° C. Dopo il terzo scambio, aggiungere l'iniziatore di N, N-dimetil-p-toluidina (Sigma-Aldrich, # D9912) di GMA ad una concentrazione di 1,5 microlitri / 1 ml GMA e applicare questa soluzione per ogni stampo campione. Immediatamente posizionare il campione nello stampo incorporamento nel AFS. Si noti che il perossido di benzoile è il catalizzatore ed è presente durante tutte le fasi di infiltrazione modo agitazione non è necessaria. Perossido di benzoile non polimerizzare la plastica finché non viene esposto alla iniziatore chimico N, N,-dimetil-p-toluidina. L'iniziatore attiva polymerization immediatamente e polimerizzare la resina anche nei tessuti entro 1 ora. Tuttavia, forcellini tessuto può causare tessuti profondi dovuti alla polimerizzazione incompleta. Inoltre, GMA non reticolare il campione al blocco bene, quindi separare il campione dal crioprotettore toccando sulla matrice dei batteri. Se la polimerizzazione è effettuata al di fuori di un AFS, lo stampo incasso deve essere coperto con un disco Aclar per bloccare l'esposizione all'ossigeno. GMA non polimerizza completamente quando esposti all'ossigeno. Lasciare che la plastica per curare durante la notte, anche se polimerizza entro 1 ora. Conservare il campione in un sacchetto pieno di gas azoto sotto vuoto (Ziploc) nel congelatore (-20 ° C) fino ad ulteriore lavorazione in modo che le proteine ​​fluorescenti non sono esposti all'ossigeno. 4. Sezionamento Sezionamento della GMA-integrati campioni può essere effettuata in modo simile a quello per EPON-integrati esemplari. Prestare particolare attenzione dovrebbe essere prenderen non bagnare la superficie sezionamento, perché GMA è molto idrofilo ed i nastri sarà guidato nella vasca d'acqua se sono bagnate su entrambi i lati. Raccogliere nastri di sezioni (50-80 nm) su un vetrino coprioggetto se un microscopio TIRF viene utilizzato per la localizzazione. Altrimenti, utilizzare una griglia fatta per la microscopia elettronica a trasmissione. La velocità di taglio deve essere impostata at1.6 mm / s o superiore. Altrimenti, un nastro non può formare. Sezioni Conservare a -20 ° C, se non immediatamente immaginato. Proteggere i fluorofori dalla luce UV, coprendo i titolari di sezione con un foglio di alluminio. 5. PALM Imaging Impostare il microscopio PALM secondo le indicazioni del produttore. La temperatura di una telecamera EMCCD dovrebbe essere impostato a -70 ° C o inferiore. Applicare particelle d'oro (# 790.122-010 – 2x concentrato, microsfere-nanospheres.com) in soluzione (circa 50 ml) al campione da acquisire. Lasciare che la soluzione a sedere per 30 secondi sulle copertinelabbro mentre sotto un caso di copertura nera. Rimuovere la soluzione oro soffiando al bordo del vetrino e assorbire con un Kimwipe. Inserire il vetrino coprioggetto in un supporto circolare. Se necessario, applicare grasso per vuoto sul cerchio per mantenere il coprioggetto in posizione. Applicare l'olio di immersione per la parte inferiore del coprioggetto, direttamente sotto i campioni. Inserire il supporto del campione nella fessura sul palco del microscopio. Fare attenzione a non toccare gli obiettivi. Regolare il supporto in modo che non sia stretta e centra le sezioni di cui sopra l'obiettivo. Individuare le sezioni usando una lente 10x obiettivo. Passare alla lente obiettivo 100x. Concentrarsi sul provino. Individuare una regione di interesse osservando la potenza dei segnali di fluorescenza. Utilizzare il laser 488 nm e aumentare l'intensità nel menu Canali al 10%. Concentrarsi sulle aree di brillanti fluorescenza. Si noti che questo passaggio non è necessario se la regione of interesse possono essere identificati nel campo chiaro a occhio. Passare il laser a 561 nm e aumentare l'intensità al 100% per la candeggina autofluorescenza sfondo. Candeggina il campione per ~ 2 min. Se le modifiche di messa a fuoco durante la sbianca, permettono di trascorrere 5 minuti prima di regolare la messa a fuoco e la cattura delle immagini. Questa pausa consente la stabilizzazione della temperatura. Se la portata PALM è dotato di una camera di incubazione, impostare la temperatura a 20 ° C e attendere ~ 2 ore per stabilizzare le temperature in camera. Quando lo sbiancamento è completa, attiva il laser 405 nm e impostare la più bassa intensità. Iniziare a raccogliere le immagini a 20 fotogrammi al secondo. Abbiamo tipicamente raccogliere 5.000-6.000 fotogrammi al esperimento, ma il numero di frame dovrebbe essere regolata a seconda della meta dell'esperimento. Ad esempio, se tutte le proteine ​​in una regione di interesse deve essere stampato, il numero di frame dovrebbe essere aumentato. Se i segnali sono scarsi o deboli, lentamente Increase l'intensità del laser 405 nm. Durante il processo di acquisizione, essere sicuri di mantenere i campioni a fuoco con cura regolando la manopola, se necessario. Quando le immagini sono raccolti, l'analisi PALM deve essere eseguita. Per tdEos, filtriamo tutti i segnali che reagiscono più di 500 msec, perché i segnali sono probabilmente a causa di autofluorescenza. 6. SEM Imaging Prima SEM imaging, macchia le sezioni usando acetato di uranile 2,5% (in acqua) per 4 min. Lavare l'acetato di uranile con acqua filtrata MilliQ. Dopo le sezioni vengono essiccati, il carbonio-rivestire il coprioggetto utilizzando un carbonio polverizzazione fino a quando il vetrino diventa piuttosto buio. Applicare una estremità del nastro di carbonio conduttivo sul bordo del vetrino e l'altra estremità sulla matrice metallica in modo che gli elettroni che si accumulano sulla superficie del vetrino sono collegate a massa. Montare il campione nella camera di SEM (FEI Nova Nano). Inserire il rivelatore VCD. </li> Chiudere la camera e la pompa utilizzando l'impostazione di alto vuoto. Una volta evacuato, aprire la valvola di colonna in modo che il fascio di elettroni viene applicata a un campione. Eseguire un allineamento di routine di fascio di elettroni. Individuare il campione. Una volta che la messa a fuoco viene regolata, collegare la fase di campione e portare il palco a 5 mm sotto il polo. Prendere un'immagine a bassa ingrandimento del campione (~ x 5000). Zoom nella regione di interesse e ottenere un alto ingrandimento (50.000 x) le immagini. Passare alla sezione successiva e ripetere il punto 6.10) e 6.11) fino a quando tutte le sezioni vengono esposte. 7. Allineamento PALM e EM immagini Aprire Photoshop e le immagini acquisite SEM. Creare una nuova finestra con dimensioni di 5.000 x 5.000 pixel e 300 pixel / pollice di risoluzione. Copiare l'immagine a basso ingrandimento SEM nella nuova finestra (Figura 1A). Ridimensionare l'immagine in modo che si riempiel'intera finestra, utilizzando la manipolazione di trasformazione (Command + T per Mac). Copiare i forti ingrandimenti immagini SEM e scalare se necessario. Capovolgere l'immagine TIRF somma orizzontale selezionando rotazione immagine dalla barra immagine menu a discesa. Copiare e incollare l'immagine somma TIRF (da PALM) in un nuovo livello. Scalare l'immagine usando la manipolazione trasformazione e quindi ruotare come necessario abbinare la fluorescenza delle particelle d'oro (frecce bianche in figura 1A) con le corrispondenti strutture visualizzati nelle SEM (Figura 1B). Copiare l'immagine PALM in un nuovo livello e applicare la stessa trasformazione (Figura 1C). Un'immagine ingrandimento maggiore può essere estratto da questa immagine (Figura 2). Per la presentazione, copiare l'immagine PALM trasformato in un nuovo livello. Selezionare i segnali PALM ma non sfondo usando "la gamma di colori" in "selezionare" menu a discesa. Assicurati di select un pixel di sfondo come un pixel di riferimento e attivare l'opzione "invertire". Tagliare i segnali PALM desiderati e incollarli in un nuovo livello. Applicare la trasparenza per il livello di sfondo, e impostarlo al 10%. Questo permette la visualizzazione dei segnali PALM rendendo trasparente lo sfondo senza compromettere la loro intensità (Figura 2D). 8. Risultati rappresentativi Istone etichettato con tdEos può essere stabilmente espressa nel nematode C. elegans, e gli animali transgenici sono stati elaborati usando il protocollo descritto sopra. Le micrografie palma e di elettroni sono stati acquistati dalla stessa sezione (Figura 1). Per allineare le immagini, l'immagine somma TIRF, che riassume la fluorescenza nel corso intero tempo, viene sovrapposta al microscopio elettronico. Le nanoparticelle di oro appaiono in entrambe le micrografie fluorescenza ed elettronica e può essere utilizzato per allineare le due immagini usando il 'TRANSFfunzione orm 'in Photoshop (Figura 1A e B). Quindi, lo stesso valore di 'trasformazione' stato applicato all'immagine PALM (Figura 1C). A questo ingrandimento, dettagli strutturali non possono essere distinti, quindi abbiamo ingrandito in una regione vicino all'estremità superiore della micrografia (Figura 2). Nell'immagine alto ingrandimento, dettagli subcellulari, come un nucleo, nucleolo, pori nucleari, reticolo endoplasmatico e poteva essere osservato. Inoltre, le molecole sono contrassegnati Histone esclusivamente localizzata nel nucleo, ma non al nucleolo, come previsto. La microscopia correlativa PALM ed elettronica permette così per la localizzazione della proteina con la massima risoluzione. Cinque problemi possono compromettere la qualità delle immagini. In primo luogo, cristallo danni ghiaccio può falsare la ultrastruttura (figura 3A e B). Posizionamento di esemplari in un crio-protectant come batteri, il che riduce la propagazione di cristalli di ghiaccio, in grado di ridurre questi danni. Tuttavia,si deve ancora vagliare campioni al microscopio elettronico e scartare quelli con artefatti di congelamento. In secondo luogo, GMA non attraversa-link per i tessuti come le resine epossidiche, e quindi i campioni spesso staccarsi dalla plastica circostante e allungare, accorciare o addirittura cadere della sezione (Figura 3C e D). Dissezione del campione lontano dai batteri o altri crio-protectant prima incorporamento prevede una maggiore aderenza della plastica per il campione (Figura 3C). Analogamente, strutture come goccioline lipidiche nell'intestino spesso dissociano dai tessuti per l'assenza di cross-linking (Figura 3E). Terzo, la polimerizzazione incompleta di cause plastica stiramento o piegatura dei tessuti (Figura 3F), la presenza di ossigeno nel campione impedisce anche la polimerizzazione del GMA. Quarto, la scarsa qualità di sezionamento GMA traduce spesso in una morfologia incoerente (figura 3G e H). GMA sezioni devono essere tagliati a70 nm o più spessa e ad una velocità di circa 1,6 mm / s per ridurre artefatti sezionamento. In quinto luogo, autofluorescenza fondo dalla polvere sul vetrino o sezione è inevitabile. Autofluorescenza dalla polvere possono essere minimizzati con l'uso pre-puliti coprioggetti ed evitando la contaminazione da polvere da Kimwipes e carta da filtro, come descritto nel protocollo. Il programma di analisi PALM possibile modificare i segnali dal campione o plastica che reagiscono più segnali tipici proteine ​​fluorescenti (Figura 2 A e B). L'immagine finale sarà quindi privo di tali manufatti. Figura 1. Allineamento al microscopio a fluorescenza ed elettronica utilizzando nanoparticelle d'oro. (A) A partire microscopio elettronico ingrandimento di una sezione trasversale di C. elegans che esprimono le tdEos etichetta istone :: HIS-11. Bianco arrows indicano 100 nm elettrone-denso nanoparticelle di oro applicato prima di imaging PALM che fungono da punti di riferimento. (B) Le perle d'oro fluorescenza in seguito all'esposizione alla luce ~ 580 nm e di creare punti di riferimento nel immagine di fluorescenza. L'immagine somma TIRF è allineata su un microscopio elettronico sulla base della posizione dei punti di riferimento. L'immagine somma TIRF rappresenta tutti i fotoni rilevati dalla fotocamera durante il corso di tempo sperimentale. Si noti che i punti luminosi in alto a sinistra (freccia bianca) derivano da ammassi di particelle d'oro. (C) Un PALM immagine viene quindi aggiunto al microscopio elettronico e ruotata e traslata in base ai valori determinati dalla allineamento dell'immagine somma TIRF in (B). Clicca qui per ingrandire figura . <br /> Figura 2. Correlativo nano-FEM utilizzando proteine ​​di fusione Histone. (A) immagine Somma TIRF di tdEos :: HIS-11 acquistati da una sezione sottile (70nm). (B) l'immagine corrispondente di tdEos PALM :: HIS-11. Autofluorescenza (freccia bianca) della durata di più di 500 msec è stato filtrato dal programma PALM. (C) al microscopio elettronico di un nucleo acquisita dalla sezione stessa. (D) immagine PALM correlativa e al microscopio elettronico di tdEos :: HIS-11. Fluorescenza è strettamente localizzata nella cromatina nel nucleo. Figura 3. Problemi associati con nano FEM. (A) al microscopio elettronico di una C. elegans muscolare corpo senza danni cristalli di ghiaccio. (B) al microscopio elettronico di un muscolo del corpo con danni di cristalli di ghiaccio. Invece di discrete sezioni, filamenti di actina e miosina sono compressi in aggregati dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio. (C, D) a basso ingrandimento al microscopio elettronicos, che mostra la dissociazione di vermi da parte dei media circostanti. La sezione è più distorta in un campione che è circondato dalle crio-protezione batteri (D) rispetto a quando il campione è circondato da plastica (C). Il batterica crio-protettore della gallette deve essere sezionato lontano dal campione fisso prima di incasso in plastica. Si noti che l'animale sulla destra in (D) è stato sezionato obliquamente, e quindi la forma non è dovuta alla distorsione dei tessuti. (E) al microscopio elettronico di intestino, mostrando forcellini di tessuti (frecce nere). (F) al microscopio elettronico anello nervo, mostrando piegatura delle sezioni a causa della polimerizzazione incompleta di plastica (frecce nere). (G, H) micrografie elettroniche di neuroni dallo stesso campione, sezionati in date diverse. La conservazione dei tessuti è superba in un solo giorno (G), ma questa morfologia è oscurata dalla qualità sezionamento incoerente (H). Clicca qui per view figura più grande.