Controllo della dimensione, forma e stabilità dei polimeri supramolecolari in acqua

Schema 1. Auto-assemblaggio di BTA basati discotici in tampone citrato in aggregati sferici dimostrano diametro di circa 5 nm, a concentrazioni millimolare di building block. Aumentando la forza ionica con l'aggiunta di NaCl risultati nella formazione di aste allungati con un diametro di circa 3 nm e la lunghezza> 25 nm. per vedere figura maggiore . 1. Preparazione di una BTA-Gd (III) Soluzioni DTPA per la spettroscopia CD e misurazione della temperatura-dipendente Spectra CD come una funzione della concentrazione di NaCl Preparare un tampone citrato 100 mM (pH 6,0). Preparare una 100 mM tampone citrato (pH 6,0) con 2 M NaCl. Sciogliere 0,254 mg di BTA-Gd (III) DTPA (MW = 3184 g • mol -1) in 10 ml di 100 mM di tampone citrato, target concentrazione di 8 • 10 -3 mm di BTA-Gd (III) DTPA. Sonicare la soluzione per 5 minuti. Riempire una cuvetta 1 centimetro UV con la soluzione e misurare uno spettro CD da 230 a 350 nm e una curva di raffreddamento CD alla banda alta intensità CD (ad esempio À = 269 nm) 363-283 K ad una velocità di 1 K min – 1. Aggiungere lo stesso volume di 2 M NaCl soluzione tampone al citrato soluzione tamponata di BTA-Gd (III) DTPA per aumentare la forza ionica di 1 M NaCl, diluendo i discotici alla metà della concentrazione, concentrazione target 4 • 10 -3 mM di BTA-Gd (III) DTPA. Vortex la soluzione con maggiore forza ionica per 5 minuti. Misurare uno spettro CD da 230 a 350 nm e una curva di raffreddamento CD alla banda alta intensità CD 363-283 K ad una velocità di 1 K min -1. 2. Montaggio delle T-dipendenti CD dati ad un modello per T-dipendonoent self-assembly I dati grezzi del CD sono stati esportati in origine 8.5 e normalizzato. Questo è stato ottenuto definire l'effetto CD alla massima temperatura misurata come uguale a 0, e l'effetto CD alla temperatura minima misurata come uguale a 1. Poiché la grandezza del CD-effetto è proporzionale al grado di aggregazione 8, i CD-curve normalizzate sono proporzionali al grado di aggregazione. I dati normalizzati sono stati montati utilizzando l'opzione non lineare curva in OriginPro 8,5 con un T-dipendente di auto-assemblaggio modello derivato da van der Schoot 8,9. In questo modello, una nucleazione e un regime di allungamento si distinguono. Innanzitutto il grado di aggregazione in regime allungamento (T <t e) è stato montato, secondo la seguente equazione: sopra equazione contiene (accanto alla temperatura variabile, t, e il grado di aggregation Φ n) tre parametri, cioè l'entalpia allungamento h, l'allungamento t (la quale l'auto-assemblaggio inizia) parametro sat, che viene introdotto a garantire n > • s -1. Come riferimento, l'auto-diffusione di HDO in D 2 O è stata misurata in un 2 VARIAN Hz D 2 O campione standard e calibrato al suo valore standard. Il modello usato per calcolare il raggio idrodinamico R H degli aggregati è il Stokes-Einstein per la diffusione di una particella sferica. 5. Risultati rappresentativi 1 H-NMR e DOSY misurazioni SAXS su BTA-M (III)-DTPA: oggetti sferici in tampone citrato Il carattere ionico delle periferiche Gd (III) introduce frustrazione nel unidimensionale crescita dei monomeri discotici cui nucleo è progettato per polimerizzare in allungati astiformi aggregati. L'equilibrio tra le interazioni attrazione e di repulsione controlla la dimensione e la forma degli aggregati (Schema 2). Schema 2. Una tecnica efficace per determinare la dimensione e la forma delle particelle in soluzione è sincrotrone fonte piccolo angolo X-ray scattering (SAXS). BTA-Gd (III)-DTPA è stato disciolto in una soluzione tampone citrato ed i profili SAXS sono stati registrati e montato nella regione 0,01 <q <0,1 Å -1. una pendenza tendente a zero nella regione di bassa q (q <0,06 -1) indica mancanza anisotropia forma aggregata, suggerendo la presenza oggetti sferici (figura 1). i dati misurati diverse concentrazioni sono stati montati utilizzando un fattore sferica omogenea monodisperse portando ad raggio calcolato, r, 3,2 nm. il calcolato geometrica monomerica discotici bta-gd (iii)-dtpa è 3,0 nm, che suggerisce aggregati con rapporto vicino 1. <br /> Figura 1. Profili SAXS per BTA-Gd (III)-DTPA in tampone citrato (100 mM, pH 6) a 0,5 e 1,0 mM (in alto). DOSY NMR del BTA-Y (III)-DTPA in 50 mM d 6-succinato buffer 1,0 mm (in basso). Clicca qui per ingrandire la figura . Al fine di fornire ulteriori prove per la forma sferica e nanometro dimensioni delle auto-assemblati oggetti, abbiamo effettuato 1 H-diffusione ordinato NMR (1 H-NMR DOSY) (Figura 1). DOSY-NMR permette di determinare i coefficienti di diffusione degli aggregati, da cui il raggio idrodinamico (R H) possono essere calcolate. Poiché Gd (III) è altamente paramagnetico e 1 H segnali verrebbe in tal modo notevolmente allargato, abbiamo cambiato Gd (III) per diamagnetico Y (III). I coefficienti di diffusione della amphiphile diamagnetico aggregato discotici in un buffer succinato deuterato (50 mM, PH 6, c = 1 mM) è stato determinato essere 0.69×10-10 m 2 s -1. Via di Stokes-Einstein, possiamo calcolare un raggio idrodinamico R H di 2.9 nm per gli oggetti discreti di dimensione sferica (Tabella 1). Questo formato è in eccellente accordo con il valore ottenuto dai dati SAXS per BTA-Gd (III)-DTPA. BTA-M (III)-DTPA [Mm] D t uno [10 -10 m 2 s -1] R H uno [Nm] R b [Nm] 1 0,69 2,9 3,2 uno da DOSY; b da SAXS Risultati Tabella 1. Di SAXS e misure Dosy per BTA-M (III)-DTPA. Cryo-TEM il BTA-Gd (III)-DTPA: da oggetti sferici a nanotubi di forma allungata Ulteriore prova per un controllo adeguato sulla lunghezza secondo una dimensione dello stack è stato ottenuto dalla crio-TEM micrografie. A causa della vetrificazione delle soluzioni acquose criogenico TEM conserva la morfologia strutturale dei autoassemblati aggregati ed evita essiccazione affetti relativa alla preparazione del campione convenzionale TEM. Figura 2 (a sinistra) mostra che BTA-Gd (III)-DTPA produce il sferica previsto oggetti con diametro di circa 6 nm ad una concentrazione di 1 mM, che conferma i risultati di SAXS e misure Dosy. Secondo questi risultati, siamo stati in grado di ottenere oggetti discreti auto-assemblati che possono essere considerati l'equivalente supramolecolare di macromolecole dendritiche 10. . Figura 2 Cryo-TEM immagini per BTA-Gd (III)-DTPA (a sinistra) 1 mm vetrificato a 298 K in tampone citrato (100 mM, pH 6), barra della scala rappresenta 50 nm;(A destra) 1 mM vetrificato a 298 K in tampone citrato (100 mM, pH 6) e una concentrazione complessiva di NaCl 5 M, barra della scala rappresenta 50 nm. Finora abbiamo lavorato solo in soluzioni tampone a bassa forza ionica. Tuttavia, se elettrostatiche forze repulsive della periferica caricata M (III)-DTPA complessi su BTA-Gd (III)-DTPA sono all'origine della frustrato unidimensionale crescita, si prevede che aumentando la forza ionica dell'ambiente tamponata, utilizzando un inerte 01:01 sale con controioni altamente idratati, dovrebbe ridurre le interazioni elettrostatiche e quindi un diverso tipo di auto-assemblato oggetto deve essere formato. In tampone citrato comprendente 5 M NaCl questo effetto è stato effettivamente osservata (figura 2, destra). La formazione di elevato allungamento astiforme polimeri supramolecolari è chiaramente osservata in Cryo-TEM microscopio ad alta forza ionica. Lo screening elettrostatica è la spiegazione più probabile per questo risultato. I cambiamenti di forma da una SPHEaggregato mochimico di circa 6 nm di diametro di aste allungate con diametro di 6 nm e la lunghezza di fino a diverse centinaia di nanometri. Misurazioni CD di BTA-Gd (III)-DTPA: accendere cooperativa di auto-assemblaggio aumentando la forza ionica Dicroismo circolare (CD) spettroscopia misura la differenza di assorbimento tra mancini e destri luce polarizzata circolarmente. Quando un oggetto elicoidale ha un senso preferito elicoidale, a sinistra e mano destra luce circolarmente polarizzata sarà assorbita in misura diversa, quindi dando luogo ad un CD-effetto. Poiché i legami idrogeno intermolecolari formato tra consecutive BTA-Gd (III)-DTPA negli aggregati, sono allineati in modo elicoidale e il centro stereogenico alla L-fenilalanina porzione favorisce un senso elicoidale sull'altra, ci aspettiamo un CD chiaro spettro di BTA-Gd (III)-DTPA aggregati base 11,12. Inoltre, in funzione della temperatura spettroscopia CD è un potentestrumento per valutare l'auto-assemblaggio del meccanismo BTA-Gd (III)-DTPA polimerizzazione e permette di trarre conclusioni sulla stabilità degli aggregati formate 13. Come esempio, la temperatura ambiente spettri CD di BTA-Gd (III)-DTPA (mM 8×10 -3 o mM 4×10 -3 in un tampone 100 mM citrato) con concentrazione salina crescente (0 M NaCl di 1,0 M NaCl) sono riportati in figura 3A. Sebbene una concentrazione significativamente inferiore è applicato per le misurazioni CD, l'effetto Cotton chiaro indica la presenza di aggregati intatte, anche a concentrazioni micromolari. La forma delle modifiche spettro dei CD sulla aumentando la concentrazione salina, che è una buona indicazione di interazioni ridotte alla periferia del pacco e migliore imballaggio dei discotici. Inoltre, le curve di raffreddamento CD delle stesse soluzioni (363-283 K, misurato a λ = 269 o 278 nm) mostrano differenze tra le forme (Figura 3B). L'APT-madre e la temperatura alla quale inizia aggregazione-sposta a temperature superiori a maggiore concentrazione di sale e un meccanismo sempre cooperativa, caratterizzato da un aumento più brusco del CD-effetto, diventa evidente. Considerando che la curva di raffreddamento a 0 M NaCl è meglio descritta da un isodesmic auto-assemblaggio, la curva di raffreddamento a 1,0 M NaCl è tipico per una cooperativa auto-assemblaggio 14. Nel primo caso, tutte le costanti di associazione sono assunto pari, mentre nel secondo caso auto-assemblaggio avviene in almeno due fasi distinte. Nella prima fase, un "nucleo" deve essere formato che è energeticamente altamente sfavorevole. Dopo raffreddamento sotto di una temperatura critica di polimerizzazione, allungamento e la crescita esponenziale in polimeri supramolecolari di alto peso molecolare segue. Quantificare i parametri termodinamici di auto-assemblaggio di BTA-Gd (III)-DTPA a 0 e 1 M NaCl usando un modello cooperativo rivela chiaramente la diminuzione K <sub> a, che è l'attivazione adimensionale costante 8. Valori più bassi per K uno indicano un più elevato grado di cooperatività nel auto-assemblaggio, che è espresso nella formazione di polimeri supramolecolari molto allungate come osservato in crio-TEM. BTA-Gd (III)-DTPA C NaCl K uno 8 x10 -3 mm 0 M 5 10 -2 4 x10 -3 mm 1 M 1 -4 10 Tabella 2. Grado di cooperatività espressa da K a nella dipendente dalla temperatura auto-assemblaggio di BTA-Gd (III)-DTPA come una funzione della concentrazione di NaCl (C NaCl). Figura 3. BTA-Gd (III)-DTPA in tampone citrato 100 mM (c = 8 mM x10 -3 a bassa forza ionica e 4 mM x10 -3 ad alta forza ionica) A] spettri CD registrati a 293 K in funzione della forza ionica , c = 0 M NaCl – 1,0 M, il Δε ellitticità molare è calcolato come segue: Δε = CD-effetto / (CXL) in cui c è la concentrazione di BTA in mol L -1 e L è la lunghezza del percorso ottico in cm ; B] corrispondenti curve di raffreddamento Cd misurato a λ = 269 nm per 0 M NaCl e 278 nm per 1 M NaCl soluzioni espressa come il grado di aggregazione Φ n in funzione della concentrazione di NaCl c = 0 M NaCl – 1,0 M, Φ n è calcolato dividendo il CD-effetto misurato dal massimo CD-effetto.