Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

1. Preparación de los platos Los platos utilizados para el cultivo rebanada son de vidrio de fondo (con un cubreobjetos como la base) (platos Willco). Estos se colocan en el tejido objetivo en un plato de cultivo de tejidos de 6 cm para mantener el fondo de vidrio limpio. En el día antes del experimento, se añaden 2 ml de 0,1% de poli-L-lisina solución al plato de vidrio de fondo y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir que el de poli-L-lisina cubrir el fondo de vidrio. Quitar poli-L-lisina solución y enjuagar tres veces en agua desionizada, y luego una vez en 70% de etanol. Dejar secar durante la noche. Los platos también puede ser secado mediante calentamiento suave en un horno de microondas a baja potencia durante 30-45 segundos. 2. La electroporación de embriones Incubar los huevos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) la etapa 10 (~ 36 horas) (o de otra etapa se desea). Antes de comenzar la preparación agujas de vidrio (se utiliza un Flaming / el modelo de Brown p87 extractor microcapilar) y romper la punta de la Needle con una pinza fina bajo un microscopio de disección. El extremo de la aguja debe ser lo suficientemente afilada para perforar el embrión si bien no es tan estrecho que impide la inyección de la solución de ADN. Huevos de ventana y electrodos lugar (5 mm de separación) a cada lado del embrión Inyectar ADN (~ 0,025 a 0,5 mg / l en agua desionizada coloreada con una pequeña cantidad de verde rápido) en el tubo neural. Aplique corriente – 17.12 V tres veces, la longitud de pulso de 50 ms a 950 ms entre pulsos. Usamos bajas concentraciones de ADN y los voltajes bajos de electroporación para lograr la expresión del mosaico de modo que puede seguir las células individuales. Cubra ventana en la cáscara del huevo con cellotape y asegúrese de que está sellado. Permita que los embriones para recuperar durante 3-4 horas o toda la noche a 37 ° C. 3. El colágeno y la rebanada preparación Cultura Medio Prepare la mezcla de colágeno y la rebanada de medio de cultivo alrededor de una hora antes de rebanar. Para 300 t lipo de un colágeno añadir 100 ml de solución al 0,1% de ácido acético y 100 l 5 x L15. Mezclar bien después de cada adición. La solución debe tornarse amarilla. Ahora agregue 15-20 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y mezclar bien. La solución debe ser ligeramente rosa, y el volumen de bicarbonato de sodio requerida para este puede variar. Mantenga en hielo y se forman de nuevo cada vez. A 10 ml de medio neurobasal añadir B-27 y suplemento Glutamax, a una concentración de 1 x 10 solución final y gentamicina l. Colocar en medio de una incubadora a 37 ° C tamponada con un 5% de CO 2. Dejar la parte superior del contenedor suelta para permitir que se equilibre con el CO 2. 4. Slice Cultura Eliminar embriones de huevo y se lava en medio L15. Colocar en un plato de cultivo de tejidos con una capa de Sylgard en la parte inferior y el pin a través de los alrededores de extraembrionarios membranas de manera que se tensa. El uso de un micrófonoroknife, embrión de corte lo más recto posible a través de la región de interés. Para la médula espinal, lonchas han de ser entre 1-2 somitas de espesor. Agregar las rebanadas unidas al embrión, mientras que se mire otros embriones para que no perderlos. Preparar una punta de micropipeta 200 l cortando aproximadamente 1 mm de la punta y colocar esto a un P2 o P10. Esta punta se utiliza para transferir las rebanadas de la médula espinal a la placa inferior de vidrio. Una propina de 10 l no es lo suficientemente amplio como para recoger las rebanadas. Cubra el interior de la punta con el colágeno con la pipeta una mezcla de colágeno l preparado con anterioridad. Dejar reposar 1-2 minutos y luego enjuague con medio L15. Esto evitará que el tejido se adhiera a la parte interior de la punta. Separar sector a partir de embriones utilizando un microknife y retirar de la cápsula, utilizando un P2 o P10 equipada con una punta de 200 l, y pone a 1 l. Trate de tomar como medio lo menos posible. Vortex la mezcla de colágeno y caída de 5-8 l de esto en el plato revestido de poli-l-lisina. Immediatamente puesto rebanada de embrión en el colágeno y la posición en el lugar con un par de pinzas finas. Las rebanadas deben colocarse de modo que la cara que se visualiza está a ras con el cubreobjetos. El tejido debe adherirse a la capa de poli-l-lisina en el cubreobjetos. Repita esto hasta que tenga varios cortes en el cubreobjetos. Por lo general, se puede colocar 6-9 rebanadas en un plato. Una vez que todas las rebanadas están en su lugar, cubrir el plato y permitir que el colágeno para establecer durante 20 minutos. Algunos de los primeros colágeno puesto que ya puede haber comenzado a secarse. Para evitar esto añadir una pequeña cantidad de L15 a éstos antes de cubrir. Una vez configurado, añadir con cuidado medio de la cultura 2ml sector que ha sido equilibrada en el 5% de CO 2 a 37 ° C durante al menos una hora. Se debe tener cuidado de no desconectar el colágeno de la cubreobjetos. Colocar en un 37 ° / 5% de CO 2 incubadora y permitir rebanadas para recuperar por lo menos 3 horas antes de imágenes. Si no hay humedad, plato lugar en una caja de plexiglás ingenioha poco de pañuelo de papel humedecido en una esquina. 5. Rebanadas de imágenes de embriones Nosotros utilizamos un procesador Core DeltaVision de campo amplio microscopio equipado con una cámara de WeatherStation ambiental a sectores de la imagen. La cámara se mantiene constantemente a 37 ° C, con un aparato de perfusión de CO 2 para mantener la platina del microscopio a 5% de CO 2/95% aire. Imagen se lleva a cabo normalmente utilizando un 40 x / 1,30 aceite de NA lente de inmersión y las imágenes son capturadas con una HQ2 CoolSnap enfrió cámara CCD. Z-secciones son capturados cada 1,5 micras a través del tejido 45 micras. El tiempo de exposición debe mantenerse tan bajo como sea posible. Normalmente, para exponer 5-50 ms para cada sección Z. Las imágenes se capturan cada 7 minutos y un máximo de nueve cortes se pueden visitar mediante un punto preciso del sistema DeltaVision de visitar la función. 6. Los resultados representativos Un ejemplo de lapso de tiempo la secuencia de una célula de la médula espinal es progenitorse muestra en la fig. 2a y una película correspondiente. Imágenes se inició en una rebanada de la médula espinal de una de dos días de edad (estadio HH 12) embrión. Esta célula se transfectó con un constructo que expresa GFP-αTubulin. Durante esta primera etapa, las células progenitoras neurales progenitoras sufren predominantemente progenitora-divisiones del modo en que las células se multiplican para generar dos células progenitoras más en bicicleta. La figura. Película 2b y la correspondiente figura 2 muestra una célula transfectadas con GFP-GPI (GPI de anclaje GFP), que marca la membrana celular. Esta célula se somete a una división durante el cual el proceso basal se divide en dos y está igualmente heredado por las células hijas. Figura 1. Slice protocolo de cultivo para el time-lapse. Figura 2. B célulaehavior durante el desarrollo normal de la médula espinal. (a) los marcos seleccionados de la película 1. La célula que expresa GFP-tubulina divide con un plano de escisión que es perpendicular a la superficie apical (2 h 20 min), generando dos células hijas que dividen una vez más (24 h 23 min y 25 min h 54). (B) los marcos seleccionados de la película 2. Celulares transfectadas con GFP-IPG se somete a la división celular durante el cual se divide el proceso basal (flechas blancas) y también heredado por las células hijas. Película 1. Haga clic aquí para ver la película . Película 2. Haga clic aquí para ver la película .