Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

1. Dish Forberedelse Retter, der anvendes til skive kultur er glasbund (med et dækglas som base) (WillCo retter). Disse er placeret på linsevævet i en 6 cm vævsdyrkningsskål at holde glasset bunden ren. På dagen før forsøget, der tilsættes 2 ml 0,1% poly-L-lysinopløsningen til glasset bund skålen og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur for at tillade poly-L-lysin til overtrækning af glasset bunden. Fjerne poly-L-lysinopløsningen og skylles tre gange i deioniseret vand og derefter en gang i 70% ethanol. Lad det tørre natten over. Retter kan også tørres ved forsigtigt at opvarme i en mikrobølgeovn med lav effekt i 30-45 sekunder. 2. Embryo Elektroporation Inkuberes æggene ved 37 ° C i Hamburger-Hamilton (HH) trin 10 (ca. 36 timer) (eller anden ønsket stadium). Inden du begynder forberede glas nåle (vi bruger en Flaming / Brown model p87 mikrokapillær aftrækker) og brække spidsen af ​​needle hjælp af en fin pincet under et dissektionsmikroskop. Den ende af kanylen skal være skarp nok til at gennembore embryo uden at være så smal, at det hæmmer injektion af DNA-opløsning. Window æg og placere elektroder (5mm mellemrum) på hver side af fosteret Injicere DNA (~ 0,025-0,5 mg / ul i deioniseret vand farvet med en lille mængde fast green) i neuralrøret. Anvend nuværende – 12-17 V tre gange, 50ms pulslængde med 950 ms mellem pulser. Vi bruger lave koncentrationer af DNA og lave elektroporeringsteknikker spændinger til at opnå mosaik udtryk, så vi kan følge de enkelte celler. Dæk vindue i æggeskallen med tape, og sørg for at det er forseglet. Tillad embryoner at inddrive i 3-4 timer eller natten over ved 37 ° C. 3. Kollagen og Slice dyrkninqsmedium Forberedelse Forbered kollagen mix og skive dyrkningsmediet cirka en time før udskæring. Til 300 gl tART en collagen tilsættes 100 ul 0,1% eddikesyre-opløsning og 100 gl 5 x L15 medium. Vortex grundigt efter hver tilsætning. Løsningen skal blive gul. Nu tilsættes 15-20 ul 7,5% natriumbicarbonat og grundigt vortex. Opløsningen bør være svagt lyserødt, og mængden af ​​natriumbicarbonat der kræves til denne kan variere. Hold på is og fyldes op frisk hver gang. Til 10 ml Neurobasal medium tilsættes B-27 supplement og Glutamax, at en 1 x slutkoncentration, og 10 pi Gentamicin-opløsning. Sted medium i en 37 ° C inkubator pufret med 5% CO2. Forlader toppen af beholderen løs for at gøre det muligt at ækvilibrere med CO2. 4. Slice Kultur Fjern embryoner fra æg og vaskes i L15 medium. Sted i en vævskulturskål med et lag af Sylgard ved bunden og pin dem ud gennem de omgivende ekstra-embryonale membraner, så de er spændt. Ved hjælp af en mikrofonroknife, skive foster så lige som muligt gennem region af interesse. For rygmarv, bør skiverne være mellem 1-2 somitter tykke. Lad skiver knyttet til embryo, mens du skærer andre embryoner, så du ikke mister dem. Fremstilling af en 200 gl mikropipettespids ved afskæring ~ 1 mm af spidsen og fastgøre denne til en p2 eller p10. Denne spids vil blive anvendt til at overføre rygmarv skiver til glasset bunden skål. En 10 gl tip er ikke bred nok til at opfange skiver. Coat indersiden af ​​spidsen med collagen ved pipettering af 1 ul collagen blandes fremstillet tidligere. Lad i 1-2 minutter og skyl derefter med L15 medium. Dette vil forhindre vævet i at klæbe til indersiden af ​​spidsen. Frigør skive fra embryoer ved hjælp af en microknife og fjerne fra skålen ved anvendelse af en P2 eller p10 forsynet med en 200 ul spids og sat til en pi. Forsøger at optage så lidt medium som muligt. Vortex kollagen blandingen og dråbe 5-8 ul af denne på poly-L-lysin-overtrukne skål. Immediadigt sikrer sat embryo skive i kollagen og position på plads med et par fine tænger. Skiver skal anbringes, så at siden, der skal afbildes flugter med dækglas. Vævet bør klæbe til poly-L-lysin belægning på dækglasset. Gentag dette indtil du har flere skiver på dækglasset. Vi kan som regel placere 6-9 skiver på en tallerken. Når alle skiverne er på plads, omfatter skålen og tillade collagen for at indstille i 20 minutter. Nogle af de tidligste placeret kollagen måske allerede er begyndt at tørre ud. For at forhindre dette tilføje en lille mængde L15 til disse, før der dækker. Når de er indstillet, tilsættes forsigtigt 2 ml skive dyrkningsmedium, som er blevet ækvilibreret i 5% CO2 ved 37 ° C i mindst en time. Må drages omsorg for ikke at frigøre kollagen fra dækglasset. Sted i et 37 ° C / 5% CO2 inkubator og tillade skiver til at komme sig i mindst 3 timer før imagografi. Hvis der ikke er nogen fugtighed, sted skål i en Perspex-kasse vidha lidt fugtigt papir i det ene hjørne. 5. Imaging Embryo Skiver Vi bruger en DeltaVision Core bredt felt mikroskop udstyret med en Weatherstation miljømæssigt kammer til billede skiver. Kammeret holdes konstant ved 37 ° C med en CO 2 perfusion apparat til at opretholde mikroskopbordet ved 5% CO2 / 95% luft. Imaging normalt udføres ved hjælp af en 40 x / 1,30 NA olieimmersion objektiv og billeder er taget med et CoolSnap HQ2 afkølet CCD-kamera. Z-snit taget hver 1,5 um til 45 um væv. Ekspositionsperioden holdes så lavt som muligt. Vi normalt udsættes for 5-50 ms for hver Z-sektion. Billeder er fanget hver 7 minutter og op til 9 skiver kan besøges ved hjælp af DeltaVision systemets præcise punkt besøge funktion. 6. Repræsentative resultater Et eksempel tidsforløb sekvens af en rygmarven progenitorcelle ervist i fig. 2a og tilsvarende film 1. Imaging blev startet på en rygmarven skive fra en to dage gammel (HH trin 12) embryo. Denne celle blev transficeret med en konstruktion, som udtrykker GFP-αTubulin. Under denne tidlige fase underkastes neurale progenitorceller overvejende progenitor-stamceller tilstand divisioner under hvilken cellerne deler at frembringe to yderligere cykling progenitorceller. Fig. 2b og tilsvarende film 2 viser en celle transficeret med GFP-GPI (GPI-forankret GFP), mærkning cellemembranen. Denne celle gennemgår en division, hvor den basale proces, deler sig i to, og er lige arvet af datteren celler. Figur 1. Slice kultur protokol for time-lapse billeddannelse. Figur 2. Celle behavior under normal rygmarv udvikling. (a) udvalgte billeder fra Film 1. Celle, der udtrykker GFP-tubulin opdeler en spaltning plan som er vinkelret på den apikale overflade (2 h 20 min), hvilket genererer to datterceller, som deler igen (24 h 23 min og 25 h 54 min). (B) Udvalgte billeder fra Movie 2. Celle transficeret med GFP-GPI undergår celledeling, i hvilken den basale fremgangsmåde spaltes (hvide pile) og ligeledes arves af datterceller. Movie 1. Klik her for at se filmen . Movie 2. Klik her for at se filmen .