Desarrollo Sexual y descarga en las ascosporas Fusarium graminearum</em

1. La producción de peritecios Inocular el Centro de zanahoria agar 10 en un 6,0 diámetro cm plato de Petri con una cepa fértil de F. graminearum (se recomienda PH-1). Colocar inocularon platos bajo luces fluorescentes brillantes a temperatura ambiente (18-24 ° C) y permitir a crecer hasta micelio ha alcanzado el borde exterior de la placa de Petri (3-5 días). Las luces fluorescentes comerciales domésticos funcionar bien para estimular la formación de cuerpo fructífero y descarga. Suavemente eliminar los micelios aéreos con un palillo estéril. Distribuir 1,0 ml de 2,5% de Tween 60 acuoso a la superficie con un palo de hockey de vidrio estéril o extremo redondeado de una varilla de vidrio estéril. Volver placas a la luz. No agregue Parafilm a las placas. Después de 24 horas, la superficie de las placas deben tener un aspecto brillante. Si vuelve a aparecer el micelio, la superficie de raspado y volver a aplicar la solución de Tween-60. Observar el desarrollo de peritecios durante la próxima semana. Las etapas intermedias dedesarrollo peritecio pueden ser cosechadas raspando suavemente la superficie del agar y flash congelado para extracción de RNA (Figura 1). Esporas maduras se acumulan en la tapa de la placa por día 7. Inicialmente éstos sólo serán visibles bajo un microscopio de disección, pero por día 9, se han acumulado a la densidad suficiente como para ser visible a simple vista. 2. Ascosporas ensayo de descarga El día 6 después de la aplicación de la solución de Tween, cortar un círculo de 1 cm de diámetro del agar con un perforador de madera. Alternativamente, un bisturí puede ser utilizado para cortar un segmento de tamaño similar. El círculo puede ser cortado por la mitad y cada mitad coloca en un portaobjetos de vidrio. Orient las piezas manera que la superficie que contiene los cuerpos fructíferos es perpendicular a la superficie de la corredera, y las esporas se disparan a lo largo de la corredera. Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad durante la noche bajo las luces. Las esporas se acumulará sobrela corredera y ser visibles para el ojo desnudo a la mañana siguiente (Figura 2). Esporas acumuladas se pueden lavar fuera de la diapositiva con agua y se cuantificó si se desea. Potenciales inhibidores de descarga de ascosporas se puede ensayar por adición a la parte trasera del bloque de agar durante el montaje del ensayo. Algunos inhibidores de los canales iónicos que reducen la descarga han sido previamente ensayados con esta técnica 15. 3. Generación de progenie recombinante Inicia cruzada mediante la inoculación de agar zanahoria con dos cepas de F. graminearum (una Nit + y una nits), colocando los puntos de inoculación en los lados opuestos de la placa de Petri. Una vez que las hifas han llenado la superficie, raspar parte aérea y aplicar de Tween-60 solución como se describe anteriormente. Use un marcador para observar en el lado de la placa de Petri donde las hifas se encuentran. Volver culturas a la luz y se incuba hasta peritecios se han desarrollado, y que han cirrhiarma para formar a los peritecios lo largo de la intersección entre las dos culturas. Bajo el microscopio de disección, traer a la vista los peritecios lo largo de la intersección de las dos culturas. Utilizando un pasador de insectos, se esteriliza y se sumerge en agua estéril, toque una cirrhus a lo largo de este borde ligeramente con la punta de la clavija. La humedad en el pasador debe permitir que las cirrhus a pegarse a la clavija. Enjuague la punta de la espiga con los cirrhus en que de cada 200 l de agua estéril en un tubo Eppendorf de separar las esporas. Llama la clavija, se humedece de nuevo y elegir otro cirrhus. Elige 10 a 15 cirrhi, y colocar cada uno en un tubo separado de agua. Tubos, agitar brevemente que contiene suspendidas cirrhi. Retirar 60 l de la suspensión de esporas con una pipeta y el lugar en un medio MMTS 1 en un 9 cm de placa de Petri. Extender con un palo de hockey estéril. La suspensión de esporas restante puede ser almacenado a 4 ° C durante hasta una semana y replated si es necesario. IncubaTE a temperatura ambiente (la luz no es necesario) durante 3-5 días hasta que las colonias muy pequeñas aparecen (Figura 3). Habrá dos tipos de fenotipos entre las colonias. Las colonias de nit tendrá hifas más escasas que las colonias + Nit. Cirrhi recombinante de peritecios se muestran ambos fenotipos de colonias en proporción aproximadamente igual. Desechar las placas con colonias de sólo un fenotipo en ellos. Tenga en cuenta que a veces, más de dos fenotipos resultar debido a la segregación de otros factores. Mueva las colonias de agar V8 o de zanahoria para el almacenamiento. Colonias de prueba en agar Czapek Dox (las cepas de nit-no crece en Czapek Dox) y el PDA con el clorato (0,5 clorato de potasio M; las cepas Nit + no va a crecer en la PDA con clorato) para confirmar el fenotipo correcta. Examine estas colonias de las cualidades deseadas. 4. Los resultados representativos La producción de peritecios El objetivo es tener un césped deperitecios sin micelios o esporas aparentes. La superficie de la cultura tendrá un aspecto similar al terciopelo negro (Figura 1). A las 24 h después de la aplicación de Tween la superficie del agar debe tener un ligero brillo. Si vuelve a aparecer el micelio, a continuación, la placa no puede haber sido raspada suficiente para inducir el desarrollo peritecios. Ascosporas de descarga Siempre dio en su ensayo de varios bloques de agar de la cepa de tipo salvaje. Si no lo hacen los bomberos, entonces o bien los peritecios son demasiado jóvenes o demasiado viejos. Si son demasiado viejos, y luego las hifas numerosos aparecerá sobre la superficie de la cultura le da un tono blanquecino. Si este no es el caso, pueden ser demasiado joven, y el ensayo debe ser juzgado de nuevo en 24 horas. Ocasionalmente, los cultivos no se descargan bien, y el experimento tendrá que ser repetido. Asegúrese de realizar el ensayo en las condiciones de luz adecuadas. Progenie recombinante <p class="jove_content"peritecios> recombinante deben constituir la mayoría de los peritecios lo largo de la intersección entre las dos cepas. Por lo general, procesar 10 cirrhi de una cruz y por lo menos 4.6 de los que debe ser recombinante. Muy de vez en cuando, una mutación impide que una cepa de apareamiento. Si uno de los padres tiene un fenotipo de crecimiento aberrante, entonces, más de 2 fenotipos pueden estar presentes entre las colonias en MMTS. Figura 1. Etapas del desarrollo de peritecios en agar zanahoria. H Izquierda, de 72 años después de la aplicación de Tween. Nota pigmento rojo y peritecios muy jóvenes visible como algunos granos negros en la superficie. Derecho, a 144 h, peritecios maduros se han formado. Tenga en cuenta casi completa ausencia de micelio superficial en ambas culturas. Figura 2. Descarga ensayo. El tapón de color naranja zanahoria agar está orientado de manera Thaesporas t fuerza descargados del peritecios maduro en su superficie se puede acumular en la superficie de la lámina de vidrio. 15 horas tiempo de acumulación. Figura 3. Las diferencias de crecimiento entre Nit + y nit de colonias en medio MMTS selectiva. Las colonias de nit (puntas de flecha) son más pequeños. Las colonias Nit + (flechas) muestran un crecimiento robusto. Fotografía tomada después de 7 días.